本发明属于生物医药,更具体地,涉及一种用于检测原发性肝癌的核酸组合、试剂、试剂盒及应用。
背景技术:
1、肝癌即肝脏恶性肿瘤,可分为原发性和转移性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织,前者称为原发性肝癌,是我国高发的,危害极大的恶性肿瘤;后者称为肉瘤,与原发性肝癌相比较较为少见。转移性或称继发性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。从病因方面来说,原发性肝癌病人往往有乙型病毒性肝炎、肝硬化病史,而转移性肝癌多继发于体内其他部位,通过淋巴结转移、血行转移等方式转移至肝,此时患者的病情多已进展至晚。由于转移性肝癌和原发性肝癌在发病原因、检测特征及后续治疗等方面具有较大区别,临床诊断肝癌时及时区分原发性肝癌和转移性肝癌,直接关系后续治疗方案的制订。病理检查是鉴别原发性和转移性肝癌的金标准,但病理学检查属于有创检查。因此对于经过影像学检测已具有较明显肝脏占位的患者,有必要开发灵敏、特异的新型原发性肝癌生物标志物和检测技术,从而有效区分原发性肝癌和转移性肝癌、改善肝癌治疗效果、提高患者生存率。
2、已有一些现有技术公开了用于原发性肝癌检测的生物标志物一定程度上能够区分原发性肝癌患者、肝硬化患者和健康人,但是这些标志物是否是原发性肝癌特异性标志物尚不清楚,其诊断原发性肝癌血浆样本的灵敏度、及其诊断干扰样本和原发性肝癌阴性样本的特异性仍然有待验证。
技术实现思路
1、针对现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供了一种用于检测原发性肝癌的核酸组合、试剂、试剂盒及应用,以解决现有技术缺少能够用于检测原发性肝癌的特异性生物标志物,对于原发性肝癌血浆样本检测易出现假阳性结果、准确度低、灵敏度低,以及无法有效区分原发性肝癌和转移性肝癌等的技术问题。
2、为实现上述目的,本发明提供了一种检测多核苷酸分子甲基化水平的试剂在制备原发性肝癌检测产品中的应用,所述多核苷酸分子选自如下(a)-(b)中至少一项:
3、(a)包括seq id no.1~4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子;
4、(b)与(a)具有85%以上序列一致性的多核苷酸分子,其cpg位点与(a)保持一致。
5、优选地,所述多核苷酸分子选自如下任一组合:
6、seq id no.1和seq id no.3的组合;seq id no.2和seq id no.3的组合;seq idno.1和seq id no.4的组合;seq id no.2和seq id no.4的组合。
7、本发明提供了一种用于检测原发性肝癌的核酸组合,所述核酸组合用于检测多核苷酸分子的甲基化水平,所述多核苷酸分子选自如下(a)-(b)中至少一项:
8、(a)包括seq id no.1~4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子;
9、(b)与(a)具有85%以上序列一致性的多核苷酸分子,其cpg位点与(a)保持一致。
10、优选地,所述核酸组合用于检测如下任一组合的多核苷酸分子的甲基化水平:
11、seq id no.1和seq id no.3的组合;seq id no.2和seq id no.3的组合;seq idno.1和seq id no.4的组合;seq id no.2和seq id no.4的组合。
12、优选地,所述核酸组合包括用于检测所述多核苷酸分子的甲基化水平的引物对,和/或检测探针。
13、优选地,所述引物对选自如下引物对中的至少一组:
14、用于检测seq id no.1区域内的甲基化水平的第一引物对、用于检测seq id no.2区域内的甲基化水平的第二引物对、用于检测seq id no.3区域内的甲基化水平的第三引物对、用于检测seq id no.4区域内的甲基化水平的第四引物对。
15、进一步优选地,所述第一引物对的核苷酸序列如seq id no.9~10所示;所述第二引物对的核苷酸序列如seq id no.12~13所示;所述第三引物对的核苷酸序列如seq idno.15~16所示;所述第四引物对的核苷酸序列如seq id no.18~19所示。
16、优选地,所述检测探针选自如下检测探针中的至少一种:
17、用于检测seq id no.1区域内的甲基化水平的检测探针如seq id no.11所示;用于检测seq id no.2区域内的甲基化水平的检测探针如seq id no.14所示;用于检测seqid no.3区域内的甲基化水平的检测探针如seq id no.17所示;用于检测seq id no.4区域内的甲基化水平的检测探针如seq id no.20所示。
18、本发明还提供了一种用于检测原发性肝癌的试剂,其包括所述核酸组合。
19、本发明还提供了一种用于检测原发性肝癌的试剂盒,其包括所述核酸组合或所述试剂。
20、优选地,所述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、pcr反应试剂、质控品、内参基因的检测引物对、内参基因的检测探针中的一种或多种。
21、总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
22、(1)本发明提供的一种用于检测原发性肝癌的核酸组合、试剂和试剂盒,通过检测样本中多核苷酸分子的甲基化水平可以对原发性肝癌进行诊断,具有良好的灵敏度和特异性。该试剂盒在组织、血浆样本中均具有优异检测效果,其检测原发性肝癌组织样本的灵敏度可达96.67%,检测转移性肝癌组织样本、癌旁正常组织样本的特异性可达74.65%、93.89%;其检测原发性肝癌血浆样本的灵敏度可达87.10%,检测转移性肝癌血浆样本特异性可达80.77%,能够有效区分原发性肝癌血浆样本和转移性肝癌血浆样本,为原发性肝癌的无创检测以及鉴别诊断提供了一种新的思路。
23、(2)本发明提供了能够用于原发性肝癌检测的多核苷酸分子,且这些多核苷酸分子仅在原发性肝癌中呈现高甲基化,在转移性肝癌癌种中整体处于低甲基化,说明本发明提供的多核苷酸分子在原发性肝癌单癌种的检测中具有较高的特异性,能够较好区分原发性肝癌与转移性肝癌癌种,能够用作原发性肝癌特异性标志物。本发明提供的试剂盒通过检测样本中原发性肝癌特异性标志物的甲基化水平,对原发性肝癌的检测具有较高的灵敏度和特异性,且检测准确度高,不易出现假阳性结果。
1.一种检测多核苷酸分子甲基化水平的试剂在制备原发性肝癌检测产品中的应用,其特征在于,所述多核苷酸分子选自如下(a)-(b)中至少一项:
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述多核苷酸分子选自如下任一组合:
3.一种用于检测原发性肝癌的核酸组合,其特征在于,所述核酸组合用于检测多核苷酸分子的甲基化水平,所述多核苷酸分子选自如下(a)-(b)中至少一项:
4.根据权利要求3所述的核酸组合,其特征在于,所述核酸组合用于检测如下任一组合的多核苷酸分子的甲基化水平:
5.根据权利要求3或4所述的核酸组合,其特征在于,所述核酸组合包括用于检测所述多核苷酸分子的甲基化水平的引物对,和/或检测探针。
6.根据权利要求5所述的核酸组合,其特征在于,所述引物对选自如下引物对中至少一组:
7.根据权利要求5所述的核酸组合,其特征在于,所述检测探针选自如下检测探针中的至少一种:
8.一种用于检测原发性肝癌的试剂,其特征在于,其包括权利要求3至7任一项所述的核酸组合。
9.一种用于检测原发性肝癌的试剂盒,其特征在于,其包括权利要求3至7任一项所述的核酸组合或权利要求8所述的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、pcr反应试剂、质控品、内参基因的检测引物对、内参基因的检测探针中的一种或多种。