一种重组人Ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明属于蛋白质工程，尤其涉及一种重组人ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1、胶原蛋白占到人体蛋白质总量的25％～30％，28种胶原蛋白中i型、ii型、iii型占比为90％。人iii型胶原蛋白是由三条alpha链螺旋形成的纤维蛋白，成熟后的iii型胶原蛋白每条蛋白链含有1068个氨基酸，三条蛋白链形成3螺旋分子量接近400kda。iii型胶原蛋白上含有多个信号通路识别位点，如和整合素识别位点结合激活胶原蛋白的重生，和vonwillebrand factor结合参与伤口愈合，和ddr2结合参与细胞增殖、粘附和骨细胞生长，和lair1结合抑制炎症的发生等。iii型胶原蛋白的氨基酸序列中包含一段重复了343次的序列gly-x-y，x与y可以是任意氨基酸，但x通常是脯氨酸(pro)，y通常是羟脯氨酸(hyp)与赖氨酸(hyl)，羟化的脯氨酸和赖氨酸对维持胶原蛋白的三螺旋结构具有重要作用。且富含羟基的天然胶原能和水分子结合发生水合作用，具有促进组织生长愈合、保水、美白、滋养皮肤等功效。但在作为护肤品成分之一时，胶原蛋白天然的胶束结构和大分子量特性，使其不易透过皮肤屏障到达真皮层发挥作用。

2、胶原蛋白在市面上的主要生产方式包括动物源性胶原蛋白提取、大肠杆菌中重组表达和酵母细胞中重组表达。动物源性胶原蛋白有免疫原性风险，大肠杆菌和酵母细胞中表达的重组胶原蛋白羟化水平低，不易形成三螺旋结构或三螺旋结构不稳定，无法发挥其应有的功能。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种重组人ⅲ型胶原蛋白，本发明提供的重组人ⅲ型胶原蛋白纯度高、具有特征三螺旋圆二色谱，分子量为21.8kda，远小于天然全长的胶原蛋白，具有促细胞增殖和促细胞迁移的作用，为胶原蛋白穿过皮肤屏障发挥生物学功能减少障碍。

2、本发明的第二目的是提供所述重组人ⅲ型胶原蛋白在哺乳动物细胞中表达的方法。

3、本发明的第三目的是提供所述重组人ⅲ型胶原蛋白在制备护肤品中的应用。

4、本发明提供了一种重组人ⅲ型胶原蛋白，所述重组人ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、本发明提供了编码所述的重组人ⅲ型胶原蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、本发明提供了表达所述的重组人ⅲ型胶原蛋白的重组载体，包括初始载体和所述的基因。

7、优选的，所述初始载体包括pcdna3.1或pcdna3.4载体。

8、本发明提供了表达所述的重组人ⅲ型胶原蛋白的重组细胞，所述重组细胞中转染有所述的重组载体。

9、优选的，初始细胞为哺乳动物细胞。

10、本发明提供了所述的重组人ⅲ型胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

11、1)将所述的基因重组到初始载体pcdna3.1上获得所述的重组载体；

12、2)将编码脯氨酸羟化酶pbcv的基因重组到初始载体pcdna3.4上获得第一辅助载体，将编码赖氨酸羟化酶l230的基因重组到初始载体pcdna3.4上获得第二辅助载体；

13、3)将步骤1)所述的重组载体、步骤2)所述的第一辅助载体和第二辅助载体共转染至初始细胞中获得重组细胞；

14、4)培养所述重组细胞后，离心，收集上清液；

15、5)从所述上清液中分离获得重组人ⅲ型胶原蛋白。

16、优选的，步骤5)所述的分离包括依次进行的镍柱亲和纯化、离子交换层析和透析。

17、本发明提供了所述的重组人ⅲ型胶原蛋白、所述制备方法制备获得的重组人ⅲ型胶原蛋白在制备护肤品、软骨填充材料中的应用。

18、本发明提供了所述的重组人ⅲ型胶原蛋白、所述制备方法制备获得的重组人ⅲ型胶原蛋白在促进细胞生长愈合中的应用。

19、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

20、本发明通过对胶原蛋白序列中功能位点的分析，截取其中对三螺旋形成具有稳定作用的区域、整合素结合位点、lair1结合位点和富含丙氨酸的提高蛋白弹性的区域、帮助三螺旋形成的三聚体信号区和分泌信号肽获得的重组人ⅲ型胶原蛋白，分子量为21.8kda，远小于天然全长的胶原蛋白，圆二色谱检测具有典型的三螺旋特征峰型，具有促细胞增殖和促细胞迁移的作用，为胶原蛋白穿过皮肤屏障发挥生物学功能减少障碍。

21、本发明将编码所述重组人ⅲ型胶原蛋白的基因重组到pcdna3.1载体上，和脯氨酸羟化酶重组质粒、赖氨酸羟化酶重组质粒共转染到哺乳动物细胞中获得重组细胞，通过培养重组细胞，收集分泌到上清液中的重组人ⅲ型胶原蛋白，哺乳动物细胞来源的重组人ⅲ型胶原蛋白，克服动物源性胶原蛋白提取、工程菌来源的重组蛋白存在的具有免疫原性风险或结构不稳定的缺点。

技术特征：

1.一种重组人ⅲ型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.编码权利要求1所述的重组人ⅲ型胶原蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示或者所述基因的核苷酸序列与seq id no.2所示序列同源性90％以上。

3.表达权利要求1所述的重组人ⅲ型胶原蛋白的重组载体，其特征在于，包括初始载体和权利要求2所述的基因。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述初始载体包括pcdna3.1载体或pcdna3.4。

5.表达权利要求1所述的重组人ⅲ型胶原蛋白的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中转染有权利要求3或4所述的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，初始细胞为哺乳动物细胞。

7.权利要求1所述的重组人ⅲ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤5)所述的分离包括依次进行的镍柱亲和纯化、离子交换层析和透析。

9.权利要求1所述的重组人ⅲ型胶原蛋白、权利要求7或8所述制备方法制备获得的重组人ⅲ型胶原蛋白在制备护肤品、软骨填充材料中的应用。

10.权利要求1所述的重组人ⅲ型胶原蛋白、权利要求7或8所述制备方法制备获得的重组人ⅲ型胶原蛋白在促进细胞生长愈合中的应用。

技术总结
本发明提供了一种重组人Ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用，属于蛋白质工程技术领域，所述重组人Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码所述的重组人Ⅲ型胶原蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；本发明还提供了所述重组人Ⅲ型胶原蛋白在哺乳动物细胞中表达的方法。本发明提供的重组人Ⅲ型胶原蛋白纯度高、具有三螺旋特征圆二色谱，分子量为21.8kDa，远小于天然全长的胶原蛋白，具有促细胞增殖和促细胞迁移的作用，为胶原蛋白穿过皮肤屏障发挥生物学功能减少障碍。

技术研发人员：张曦,谭炎,徐俏冉,张影,夏益民,冯宇驰,张小燕
受保护的技术使用者：深圳粒影生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/2/17