结核分枝杆菌特异性T细胞HLA-A*0201限制性表位肽及其应用

本发明属于生物技术和医药领域，特别涉及结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞hla-a*0201限制性表位肽pmtb 6及其应用。

背景技术：

1、结核病是因结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)感染引起、全球感染率极高的传染病。mtb主要感染部位为肺部，引起肺结核。此外，mtb也可感染其他器官和组织，如淋巴结、脑、肾、脊柱等等，发生肺外结核。如今，结核病疫情呈现新的特点，即耐药结核病例越来越多，结核与艾滋病共感染情况愈演愈烈。针对这两类患者，目前并无有效的防治措施。

2、mtb是胞内寄生菌，人体对其有效控制主要依赖于细胞免疫，尤其是t细胞免疫。人体内t细胞主要分为cd4+t(th)细胞和cd8+t(ctl)细胞两大亚群，大量研究已经证明，这两种t细胞亚群对于控制mtb感染都具有重要作用，其中cd8+t更是清除结核菌的主力军。t细胞无法识别完整的结核菌和蛋白抗原，而是识别经抗原递呈细胞摄取和加工后释放出的表位肽，进而发挥免疫效应。表位肽是蛋白抗原序列中引起免疫应答的核心部份，也称为抗原决定簇，它与抗原递呈细胞表面的mhc(hla)分子结合，形成肽-hla复合物并被递送和表达在抗原递呈细胞(如树突状细胞、b淋巴细胞等)表面，进而活化t细胞，诱发t细胞免疫反应。hla i类分子将表位肽递呈给cd8+t细胞，hla ii类分子将表位肽递呈给cd4+t细胞。表位肽被t细胞识别并有效活化t细胞，要求表位肽与hla分子形成稳定的复合物，而肽与hla分子的亲和力是形成肽-hla复合物的关键。因此，获得具有免疫效应的t细胞表位肽，首要步骤是筛选出高亲和力的多肽，进而鉴定出具有免疫活性的表位肽。

3、目前，临床用于预防结核病的疫苗只有卡介苗一种，卡介苗对于儿童结核病，特别是结核性脑膜炎等重症结核病的预防效果较好，但对于预防成年人的肺结核效果较差。目前，尽管国内外对于新型疫苗的研究已成热门，但至今尚无已被证实安全有效的新型疫苗上市。基于表位肽的新型疫苗也是热点之一。表位肽可完全通过人工合成获得，研发周期短；由于剔除了活性序列以外病原体其他有害成分，安全性良好；还可以将多个表位肽串联使用，加强免疫效果和减少免疫逃逸；此外，表位肽可用于制备mhc四聚体，应用于免疫学研究和检测、特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多个方面。hla-a*0201是最常见的hla分子之一，鉴定hla-a*0201限制性表位，具有广阔的应用人群，因此具有非常重要的意义。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞hla-a*0201限制性表位肽pmtb 6。

2、本发明的另一目的在于提供该结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞hla-a*0201限制性表位肽pmtb 6在制备结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物中的应用。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、本发明提供了与hla-a*0201分子亲和力高，能活化cd8+t细胞、诱导其增殖和分泌ifn-γ的结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞表位肽，为pmtb 6：gl maaaaspyv(seq id no.6)(即：gly-leu-met-ala-ala-ala-ala-ser-pro-tyr-val)；

5、本发明还提供了上述结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞表位肽pmtb 6在制备结核病诊断试剂中的应用。

6、本发明还提供了上述结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞表位肽pmtb 6在制备治疗结核病药物中的应用。

7、本发明还提供了上述结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞表位肽pmtb 6在制备结核病预防性/治疗性疫苗中的应用。

8、所述的药物为刺激hla-a*0201型结核患者cd8+t细胞增殖的药物。

9、所述的药物为刺激分泌ifn-γ的细胞增殖的药物。

10、所述的药物为诱发针对结核病的细胞免疫应答的药物。

11、一种结核病诊断试剂盒，包括上述结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞表位肽pmtb 6。

12、一种药物组合物，包括上述结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞表位肽pmtb6。

13、优选的，所述的药物相同或不同的分别可采用常规方法制成各种药用剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂、酒剂、酊剂、滴剂等口服给药的剂型及注射液等口服以外的给药剂型，如针剂等。

14、优选的，所述的药物相同或不同的分别还可含有一种或一种以上药学上可接受的载体或赋形剂。

15、优选的，所述的赋形剂可包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂、防腐剂等。

16、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

17、(1)疫苗仍是控制结核病流行的最佳策略。目前临床上使用的卡介苗仅对预防儿童重症结核有效，对成人无直接保护作用。因此，急需研制新型疫苗。基于表位开发的多肽疫苗具有以下几个重要的优点：首先，多肽疫苗有个独特的优势，即可以选择免疫优势的表位，避免菌体或蛋白疫苗与自身组织的交叉反应而引起的自身免疫等不良反应；其次，合成肽不含遗传物质，也没有恢复毒力的问题，而这两者是减毒疫苗和突变株令人担忧之处；再次，多肽表位疫苗能够诱导比蛋白疫苗更多的免疫反应，并且能避免蛋白疫苗诱导的集中免疫；此外，表位肽可以完全通过人工合成获得，研发周期短，还可以将多个表位肽串联使用，加强免疫效果和减少免疫逃逸。然而，抗原表位构象复杂，准确筛选具有局限性，免疫原性较低，需要佐剂辅助才能产生较好免疫应答。目前发现的结核菌cd8+t表位肽主要是在欧美人群中鉴定，而对于结核病流行严重的亚洲人群效果未可知。本发明对于抗结核多肽疫苗和诊断试剂的研发具有重要意义。

18、(2)本发明结合生物信息学预测方法和紫外诱导肽置换实验，利用结核分枝杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核活性的表位肽，高效准确地检测出表位肽pmtb 6与hla-a*0201分子之间的亲和力。这是新的、未被报道过的hla-a*0201限制性结核分枝杆菌表位肽，被结核患者体内特异性cd8+t细胞广泛识别并诱导活化。hla-a*0201基因型是人群中最广泛携带的hla基因型之一，本发明表位肽的确定，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。

技术特征：

1.结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞表位肽pmtb 6，其特征在于，所述表位肽pmtb 6的氨基酸序列如seq id no.6所示。

2.权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞表位肽pmtb 6的应用，其特征在于，为下述应用之一：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的药物为刺激hla-a*0201型结核患者cd8+t细胞增殖的药物。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的药物为刺激分泌ifn-γ的细胞增殖的药物。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的药物为诱发针对结核病的细胞免疫应答的药物。

6.根据权利要求2-5任一项所述的应用，其特征在于：所述的药物的剂型为片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂、酒剂、酊剂、滴剂或针剂。

7.根据权利要求2-5任一项所述的应用，其特征在于：所述的药物还含有一种或以上药学上可接受的载体或赋形剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的赋形剂包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂或防腐剂。

9.一种结核病诊断试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞表位肽pmtb 6。

10.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性cd8+t细胞表位肽pmtb 6。

技术总结
本发明公开一种结核分枝杆菌特异性T细胞HLA‑A*0201限制性表位肽及其应用，属于生物技术和医药领域。本发明结合生物信息学预测方法和紫外诱导肽置换实验，利用结核分枝杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核活性的表位肽，高效准确地检测出表位肽pMtb 6与HLA‑A*0201分子之间的亲和力。该HLA‑A*0201限制性结核分枝杆菌表位肽，被结核患者体内特异性CD8<supgt;+</supgt;T细胞广泛识别并诱导活化。HLA‑A*0201基因型是人群中最广泛携带的HLA基因型之一，本发明表位肽的确定，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。

技术研发人员：刘苏东,古晓东,翁锐强
受保护的技术使用者：梅州市人民医院（梅州市医学科学院）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15