原核表达系统制备均一多聚体蛋白质的方法与流程

本发明涉及生物，特别涉及原核表达系统制备均一多聚体蛋白质的方法。

背景技术：

1、重组蛋白质是指利用dna重组技术生产的蛋白质。尤其涉及到体外诊断相关抗原，绝大部分蛋白质是人体蛋白或病毒蛋白，其主要作用机理作为体外诊断关键性原材料，参与在人体之外通过对人体的血液等组织及分泌物进行检测判断疾病情况。重组生产过程包括：鉴定具有与之相应病毒抗体或肿瘤标志物活性位点，合成编码该蛋白质的基因序列，然后进行pcr克隆并连接进合适的载体，转入宿主细胞中，构建可以高效表达目的蛋白的甘油菌株，最后经过使用发酵培养或生物反应器等进行大量菌株生产。

2、体外诊断相关原材料相应表达系统含有四大表达系统，大肠杆菌、酵母、杆状昆虫和哺乳动物细胞。其中，一般为了表达均一多聚体蛋白，多采用真核表达系统，如哺乳动物细胞或杆状病毒昆虫细胞等表达系统。真核表达系统主要优点更接近天然状态，但其表达量低，成本高，有不同程度的糖基化。而大肠杆菌表达系统工艺最为成熟、其培养操作简单，遗传稳定，成本低廉，但大肠杆菌不能将表达蛋白分泌到胞外，二硫键形成能力有限，因此会形成多个聚集体形式，又有大多数表达的为膜蛋白，疏水作用力较强，不能很好进行变复性工艺使其折叠成正确的结构，因此急需解决含有多个不均一聚集体的蛋白质的原核体系表达问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了原核表达系统制备均一多聚体蛋白质的方法，通过保护片段设计及制备工艺控制，使多聚体蛋白在表达过程中形成更均一的结构。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了蛋白质的表达方法，包括在重组大肠杆菌的od600值为0.6～0.8时进行诱导，16～25℃发酵，获得所述蛋白质。

4、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达方法中所述蛋白质包括含有多个二硫键和/或疏水作用力强的蛋白质；和/或

5、所述蛋白质还包括多个片段融合的蛋白质；和/或

6、所述诱导包括添加诱导剂进行所述诱导；和/或

7、所述诱导剂的终浓度为0.05～2mm；和/或

8、所述诱导剂包括iptg；和/或

9、所述发酵的时间为3～20h。

10、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达方法中所述诱导剂的终浓度为0.1～0.2mm。

11、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达方法中在获得所述蛋白质后，还包括对所述蛋白质进行纯化以及hplc-sec分析的步骤。

12、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达方法中所述纯化包括金属螯合层析、gst亲和层析和/或mbp亲和层析。

13、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达方法中所述重组大肠杆菌的制备方法包括：将表达载体转染至大肠杆菌，获得所述重组大肠杆菌；

14、所述表达载体包括一个或多个目的基因；和/或

15、多个所述目的基因之间以编码连接肽的核苷酸序列相连。

16、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达方法中所述连接肽的氨基酸序列包括(gggs)n或(eaaak)n，其中n＝3～5。

17、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达方法中所述表达载体的骨架包括pet类载体、pgex类载体或自主改造载体；和/或

18、所述一个或多个目的基因在所述表达载体上的插入位点为bamh i和xho i双切酶位点；和/或

19、所述表达载体还包括融合标签；和/或

20、所述融合标签包括gst、trx和/或mbp；和/或

21、所述大肠杆菌包括大肠杆菌通用性表达菌株；和/或

22、所述大肠杆菌通用性表达菌株包括大肠杆菌bl21(de3)和/或大肠杆菌arctic。

23、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达方法中所述pet类载体包括pet28a；和/或

24、所述pgex类载体包括pgex4t-1或pgex4t-3。

25、本发明还提供了上述表达方法制得的蛋白质。

26、本发明的方法有如下效果：

27、本发明思路为不均一聚集体的蛋白质，通过保护片段设计及制备工艺控制，使其在表达过程中形成更均一的结构，纯化过程通过控制上样量与洗脱条件可以有效控制聚体比例。

技术特征：

1.蛋白质的表达方法，其特征在于，包括在重组大肠杆菌的od600值为0.6～0.8时进行诱导，16～25℃发酵，获得所述蛋白质。

2.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述蛋白质包括含有多个二硫键和/或疏水作用力强的蛋白质；和/或

3.如权利要求2所述的表达方法，其特征在于，所述诱导剂的终浓度为0.1～0.2mm。

4.如权利要求1至3任一项所述的表达方法，其特征在于，在获得所述蛋白质后，还包括对所述蛋白质进行纯化以及hplc-sec分析的步骤。

5.如权利要求4所述的表达方法，其特征在于，所述纯化包括金属螯合层析、gst亲和层析和/或mbp亲和层析。

6.如权利要求1至5任一项所述的表达方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌的制备方法包括：将表达载体转染至大肠杆菌，获得所述重组大肠杆菌；

7.如权利要求6所述的表达方法，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列包括(gggs)n或(eaaak)n，其中n＝3～5。

8.如权利要求6或7所述的表达方法，其特征在于，所述表达载体的骨架包括pet类载体、pgex类载体或自主改造载体；和/或

9.如权利要求8所述的表达方法，其特征在于，所述pet类载体包括pet28a；和/或

10.如权利要求9所述的表达方法制得的蛋白质。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别涉及原核表达系统制备均一多聚体蛋白质的方法。该方法包括如下步骤：重组多聚体蛋白表达菌株活化，重组多聚体蛋白的诱导表达；重复多聚体蛋白的纯化；重组多聚体蛋白的分析；其中所述的重组多聚体蛋白为大肠杆菌重组表达，所述的多聚体蛋白是指直接表达后HPLC‑SEC分析存在多种不同形式的聚集体。本发明所提供大肠杆菌表达均一性多聚体蛋白的方法，为多聚体蛋白生物制备提供一条方便的生产方法。

技术研发人员：柴丹丹,王桂芳,赵枭阳,张春鸽,赵巧辉,李桂林,付光宇,杨增利,吴学炜
受保护的技术使用者：郑州伊美诺生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16