一种针对于PEDV的RAA-PfAgo检测引物及其应用

本发明涉及生物，具体涉及一种针对于pedv的raa-pfago检测引物及其应用。

背景技术：

1、全球养猪业的腹泻病最常见由pedv引起，pedv是一种包膜病毒，属于冠状病毒科和α冠状病毒属。pedv感染所有年龄段的猪，导致呕吐、急性水样腹泻、脱水和体重减轻。仔猪死亡率达到100％。自1971年在英国发现ped以来，它已经传播到许多国家，包括美国、欧洲和中国，给养猪业带来了重大的经济损失。然而，pedv在养猪场经常与其他冠状病毒共同感染，包括猪德尔塔冠状病毒(pdcov)和传染性胃肠炎病毒(tgev)，这可能会导致类似的临床症状，并使鉴别诊断具有挑战性。因此，迫切需要开发新的、简单有效的检测pedv的方法。

2、目前，已经报道了许多检测pedv的技术，包括常规病毒分离、酶联免疫吸附剂(elisa)和分子生物学技术。然而，这些技术有一定的局限性，例如需要专业人员或昂贵、复杂的设备，而且耗时且容易出现高假阳性率。目前基于cas12a的pedv检测方法快速、特异、灵敏、可靠；这些属性将对病毒性传染病poc分子诊断技术的未来发展至关重要。然而，crispr系统也有一些局限性。首先，cas蛋白只能在室温下发挥作用，在高温下失去活性，从而影响切割活性。cas蛋白需要一段grna引导来切割靶核酸；然而，rna易被降解，这使得储存和运输变得困难。此外，grna的合成相当昂贵。

3、近年来，基于pfago的检测方法，如pcr与pfago结合、lamp与pfago结合以及rpa与pfago结合已逐渐出现。这项研究的重点是raa，因为pcr需要复杂的仪器和较长的时间，而lamp在构建引物方面相当具有挑战性。此外，此前有报道称，raa和pfago被用于检测新冠病毒。虽然这项技术的特异性和敏感性非常好，但在raa扩增和扩增产物纯化后进行pfago反应的额外挑战使其容易造成气溶胶污染。

4、为此，本发明旨在提供一种针对于pedv的raa-pfago检测引物及其应用，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种针对于pedv的raa-pfago检测引物及其应用。

2、为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明提供了一种针对于pedv的raa-pfago检测引物，所述raa-pfago检测引物为一对raa引物，且引物序列分别为：

4、pedv-raa2f：gggttactaatgacaaacccctttctaagg和

5、pedv-raa2r：5′-gcaacccagaaaacaccctcagtacgagtc-3′。

6、本发明还提供了一组用于切割上述的raa产物的双链dna的gdnas，所述gdnas的序列为：

7、gdna-1：5′-cgcatgcgccagcgaa-3′，

8、gdna-2：5′-aattcgctcaccacgg-3′和

9、gdna-3：5′-caaattcgctggcgca-3′。

10、进一步地，所述gdnas切割raa产物的双链dna下来的单链dna用于切割探针。

11、进一步地，所述探针的序列为：5′6-fam-tccacggcgcatgcgccttt-bhq1-3′。

12、本发明还提供了一种针对于pedv的raa-pfago检测系统，所述raa-pfago检测系统包括raa引物产物、pfago、探针、一组gdnas和mncl2。

13、本发明还提供了raa-pfago检测系统的检测方法，将提取的病毒rna进行逆转录，在39℃条件下通过raa扩增获得的cdna30分钟，将raa产物与pfago混合，在95℃下反应30分钟，并在蓝光下观察结果。

14、本发明方案解决的技术问题的难度及意义在于：

15、与crispr相比，pfago只需要一小段gdna就可以切割靶序列，而且由于pfago对高温具有抵抗力，因此更适合现场检测。在使用raa和pfago中，本文开发了一种pedv的视觉检测方法。为了最大限度地减少假阴性的可能性，我们基于保守的pedvn基因开发了引物和gdnas。此外，通过优化扩增条件，提高了raa扩增的效率和特异性。为了降低操作的复杂性和减少污染，在39℃下使raa反应30分钟后，将raa产物直接转移到pfago系统，无需纯化，然后在95℃下加热30分钟。通过将产物暴露于蓝光下检查反应结果。由于只需要加热和蓝光设备，这种检测方法的简单性和多功能性大大增强。为了便于观察结果，将raa-pfago反应与lfd相结合，并评估了所开发方法的特异性、敏感性和实用性。根据结果，raa-pfago和raa-pfagolfd都能够检测到100个拷贝的病毒核酸，而不会与其他生物体发生交叉反应。随后使用临床样本评估该方法的可靠性，发现其与pcr方法的结果一致。

16、与现有技术相比，本方案的有益效果：

17、1、本发明的方案基于保守的pedvn基因设计了引物和gdnas；此外，通过优化扩增条件，提高了raa扩增的效率和特异性。为了降低操作的复杂性和减少污染，在39℃下使raa反应30分钟后，将raa产物直接转移到pfago系统，无需纯化，然后在95℃下加热30分钟。通过将产物暴露于蓝光下检查反应结果。由于只需要加热和蓝光设备，这种检测方法的简单性和多功能性大大增强。

18、2、本发明提供的raa-pfago检测系统的检测方法不需要要复杂的仪器设备，且在较短的时间内即可肉眼观察结果；且该方法操作简单，不需要专业的人员；且该方法的主要成份易于保存，成本较低。

技术特征：

1.一种针对于pedv的raa-pfago检测引物，其特征是：所述raa-pfago检测引物为一对raa引物，且引物序列分别为：

2.一组用于切割如权利要求1所述的raa产物的双链dna的gdnas，其特征是：所述gdnas的序列为：

3.如权利要求2所述的gdnas，其特征是：所述gdnas切割raa产物的双链dna下来的单链dna用于切割探针。

4.如权利要求3所述的gdnas，其特征是：所述探针的序列为：5′6-fam-tccacggcgcatgcgccttt-bhq1-3′。

5.一种针对于pedv的raa-pfago检测系统，其特征是：所述raa-pfago检测系统包括如权利要求1所述的raa引物产物、pfago、如权利要求4所述的探针、如权利要求2所述的gdnas和mncl2。

6.如权利要求5所述的raa-pfago检测系统的检测方法，其特征是：将提取的病毒rna进行逆转录，在39℃条件下通过raa扩增获得的cdna 30分钟，将raa产物与pfago混合，在95℃下反应30分钟，并在蓝光下观察结果。

技术总结
本发明公开了一种针对于PEDV的RAA‑PfAgo检测引物及其应用，涉及生物技术领域，其技术要点为：本发明的方案提供了一种针对于PEDV的RAA‑PfAgo检测引物、一组gDNAs和探针，其构成RAA‑PfAgo检测系统，该检测系统为使用RAA和PfAgo检测PEDV的方法。该方法可以检测100个拷贝的PEDV，而不会与其他病原体发生交叉反应。RAA和PfAgo检测PEDV的整个反应不需要复杂的仪器，反应结果可以用肉眼观察。本发明的方法中，该集成的RAA‑PfAgo切割分析是准确快速检测PEDV的实用工具。

技术研发人员：王红宁,杨鑫,赵宇,周长宇,王凯禄,张铁军
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15