本发明涉及生物,具体涉及一种针对于pedv的raa-pfago检测引物及其应用。
背景技术:
1、全球养猪业的腹泻病最常见由pedv引起,pedv是一种包膜病毒,属于冠状病毒科和α冠状病毒属。pedv感染所有年龄段的猪,导致呕吐、急性水样腹泻、脱水和体重减轻。仔猪死亡率达到100%。自1971年在英国发现ped以来,它已经传播到许多国家,包括美国、欧洲和中国,给养猪业带来了重大的经济损失。然而,pedv在养猪场经常与其他冠状病毒共同感染,包括猪德尔塔冠状病毒(pdcov)和传染性胃肠炎病毒(tgev),这可能会导致类似的临床症状,并使鉴别诊断具有挑战性。因此,迫切需要开发新的、简单有效的检测pedv的方法。
2、目前,已经报道了许多检测pedv的技术,包括常规病毒分离、酶联免疫吸附剂(elisa)和分子生物学技术。然而,这些技术有一定的局限性,例如需要专业人员或昂贵、复杂的设备,而且耗时且容易出现高假阳性率。目前基于cas12a的pedv检测方法快速、特异、灵敏、可靠;这些属性将对病毒性传染病poc分子诊断技术的未来发展至关重要。然而,crispr系统也有一些局限性。首先,cas蛋白只能在室温下发挥作用,在高温下失去活性,从而影响切割活性。cas蛋白需要一段grna引导来切割靶核酸;然而,rna易被降解,这使得储存和运输变得困难。此外,grna的合成相当昂贵。
3、近年来,基于pfago的检测方法,如pcr与pfago结合、lamp与pfago结合以及rpa与pfago结合已逐渐出现。这项研究的重点是raa,因为pcr需要复杂的仪器和较长的时间,而lamp在构建引物方面相当具有挑战性。此外,此前有报道称,raa和pfago被用于检测新冠病毒。虽然这项技术的特异性和敏感性非常好,但在raa扩增和扩增产物纯化后进行pfago反应的额外挑战使其容易造成气溶胶污染。
4、为此,本发明旨在提供一种针对于pedv的raa-pfago检测引物及其应用,以解决上述问题。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了解决上述问题,提供一种针对于pedv的raa-pfago检测引物及其应用。
2、为了达到上述目的,本发明的技术方案如下:
3、本发明提供了一种针对于pedv的raa-pfago检测引物,所述raa-pfago检测引物为一对raa引物,且引物序列分别为:
4、pedv-raa2f:gggttactaatgacaaacccctttctaagg和
5、pedv-raa2r:5′-gcaacccagaaaacaccctcagtacgagtc-3′。
6、本发明还提供了一组用于切割上述的raa产物的双链dna的gdnas,所述gdnas的序列为:
7、gdna-1:5′-cgcatgcgccagcgaa-3′,
8、gdna-2:5′-aattcgctcaccacgg-3′和
9、gdna-3:5′-caaattcgctggcgca-3′。
10、进一步地,所述gdnas切割raa产物的双链dna下来的单链dna用于切割探针。
11、进一步地,所述探针的序列为:5′6-fam-tccacggcgcatgcgccttt-bhq1-3′。
12、本发明还提供了一种针对于pedv的raa-pfago检测系统,所述raa-pfago检测系统包括raa引物产物、pfago、探针、一组gdnas和mncl2。
13、本发明还提供了raa-pfago检测系统的检测方法,将提取的病毒rna进行逆转录,在39℃条件下通过raa扩增获得的cdna30分钟,将raa产物与pfago混合,在95℃下反应30分钟,并在蓝光下观察结果。
14、本发明方案解决的技术问题的难度及意义在于:
15、与crispr相比,pfago只需要一小段gdna就可以切割靶序列,而且由于pfago对高温具有抵抗力,因此更适合现场检测。在使用raa和pfago中,本文开发了一种pedv的视觉检测方法。为了最大限度地减少假阴性的可能性,我们基于保守的pedvn基因开发了引物和gdnas。此外,通过优化扩增条件,提高了raa扩增的效率和特异性。为了降低操作的复杂性和减少污染,在39℃下使raa反应30分钟后,将raa产物直接转移到pfago系统,无需纯化,然后在95℃下加热30分钟。通过将产物暴露于蓝光下检查反应结果。由于只需要加热和蓝光设备,这种检测方法的简单性和多功能性大大增强。为了便于观察结果,将raa-pfago反应与lfd相结合,并评估了所开发方法的特异性、敏感性和实用性。根据结果,raa-pfago和raa-pfagolfd都能够检测到100个拷贝的病毒核酸,而不会与其他生物体发生交叉反应。随后使用临床样本评估该方法的可靠性,发现其与pcr方法的结果一致。
16、与现有技术相比,本方案的有益效果:
17、1、本发明的方案基于保守的pedvn基因设计了引物和gdnas;此外,通过优化扩增条件,提高了raa扩增的效率和特异性。为了降低操作的复杂性和减少污染,在39℃下使raa反应30分钟后,将raa产物直接转移到pfago系统,无需纯化,然后在95℃下加热30分钟。通过将产物暴露于蓝光下检查反应结果。由于只需要加热和蓝光设备,这种检测方法的简单性和多功能性大大增强。
18、2、本发明提供的raa-pfago检测系统的检测方法不需要要复杂的仪器设备,且在较短的时间内即可肉眼观察结果;且该方法操作简单,不需要专业的人员;且该方法的主要成份易于保存,成本较低。
1.一种针对于pedv的raa-pfago检测引物,其特征是:所述raa-pfago检测引物为一对raa引物,且引物序列分别为:
2.一组用于切割如权利要求1所述的raa产物的双链dna的gdnas,其特征是:所述gdnas的序列为:
3.如权利要求2所述的gdnas,其特征是:所述gdnas切割raa产物的双链dna下来的单链dna用于切割探针。
4.如权利要求3所述的gdnas,其特征是:所述探针的序列为:5′6-fam-tccacggcgcatgcgccttt-bhq1-3′。
5.一种针对于pedv的raa-pfago检测系统,其特征是:所述raa-pfago检测系统包括如权利要求1所述的raa引物产物、pfago、如权利要求4所述的探针、如权利要求2所述的gdnas和mncl2。
6.如权利要求5所述的raa-pfago检测系统的检测方法,其特征是:将提取的病毒rna进行逆转录,在39℃条件下通过raa扩增获得的cdna 30分钟,将raa产物与pfago混合,在95℃下反应30分钟,并在蓝光下观察结果。