高转导HSV载体的制作方法

背景技术：

1、对于具有弱药代动力学和/或脱靶不利效应的风险的试剂，某些治疗剂的全身递送可能是有问题的。在特定靶部位处的局部注射可能要求高度侵入性技术或者可能是不可行的。通过病毒载体递送试剂允许特异性靶向细胞群的能力，以提供试剂的局部产生和/或递送。

技术实现思路

1、本公开提供了用于将试剂病毒载体递送至靶细胞的组合物和方法。

2、在一些实施例中，本公开提供了单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由seq id no:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质。

3、在一些实施例中，本公开提供了单纯疱疹病毒mckrae株的变体，其具有总体尺寸小于约150,000个碱基对的截短基因组，并且包括在对应于seq id no:1的残基126049至130014的元件内的一个或多个残基的缺失。

4、在一些实施例中，本公开提供了包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体，所述基因组含有改变，使得所述变体不能表达由seq id no:2的氨基酸序列表征的功能性蛋白质。在一些实施例中，载体包含神经元特异性启动子。在一些实施例中，启动子是降钙素基因相关肽(cgrp)启动子。

5、在一些实施例中，载体包含人巨细胞病毒(hcmv)增强子。在一些实施例中，载体包含牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号。在一些实施例中，载体包含编码治疗性多肽的核酸。

6、在一些实施例中，本公开提供了用如本文所述的hsv mckrae株病毒载体转导的细胞。

7、在一些实施例中，本公开提供了药物组合物，其包含如本文所述的hsv mckrae株病毒载体和药学可接受的载体。

8、在一些实施例中，本公开提供了繁殖包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体的方法，所述基因组包含改变，使得所述变体不能表达由seq id no:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质，所述方法包括以下步骤：(i)用载体感染含有编码hsv蛋白icp4的dna的经培养的icp4互补细胞，和(ii)从步骤(i)的培养物中分离上清液。

9、在一些实施例中，该方法包括通过色谱纯化上清液中的载体的步骤。在一些实施例中，该方法包括浓缩纯化的载体的步骤。在一些实施例中，通过切向流过滤来浓缩纯化的载体。

10、在一些实施例中，本公开提供了制备包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体的方法，所述基因组包含改变，使得所述变体不能表达由seq id no:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质，并且其中所述载体表达标记物元件，所述方法包括温育用以下转染的细胞：

11、(a)第一核酸分子：

12、(i)包含hsv mckrae株基因组的一部分，但不编码由seq id no:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质；和

13、(ii)包含第一同源区(hr1)和第二同源区(hr2)，以及

14、(b)第二核酸分子，其包含编码标记物元件的序列，其中所述序列侧面为第一同源区(hr1')和第二同源区(hr2')，其中hr1与hr1'同源且hr2与hr2'同源，使得编码第二核酸分子中的标记物元件的序列经由同源重组而整合到第一核酸分子内。

15、在一些实施例中，细胞是icp4互补细胞。在一些实施例中，细胞补充icp4和至少一种其它病毒基因。在一些实施例中，细胞补充icp4和至少一种立即早期基因。在一些实施例中，细胞是icp4、icp27和ul55互补细胞。在一些实施例中，细胞是icp4、icp22和icp47互补细胞。

16、在一些实施例中，标记物元件是多肽。在一些实施例中，多肽通过荧光是可检测的。在一些实施例中，标记物元件是绿色荧光肽。在一些实施例中，该方法包括纯化表达标记物元件的病毒噬斑的步骤。

17、在一些实施例中，本公开提供了制备包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体的方法，所述基因组包含改变，使得所述变体不能表达由seq id no:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质，并且其中所述载体表达目的试剂，所述方法包括温育用以下转染的细胞：

18、a)第一核酸分子：

19、(i)包含hsv mckrae株基因组的一部分，但不编码由seq id no:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质；和

20、(ii)包含编码标记物元件的序列，其中所述编码标记物元件的序列侧面为第一同源区(hr1)和第二同源区(hr2)；以及

21、(b)第二核酸分子，其包含编码目的试剂的序列，其中所述编码目的试剂的序列侧面为第一同源区(hr1')和第二同源区(hr2')，其中hr1与hr1'同源且hr2与hr2'同源，使得编码目的试剂的序列经由同源重组整合到第一核酸分子内。

22、在一些实施例中，细胞是icp4互补细胞。在一些实施例中，细胞补充icp4和至少一种其它病毒基因。在一些实施例中，细胞补充icp4和至少一种立即早期基因。在一些实施例中，细胞是icp4、icp27和ul55互补细胞。在一些实施例中，细胞是icp4、icp22和icp47互补细胞。

23、在一些实施例中，该方法包括纯化不表达标记物元件的病毒噬斑的步骤。

24、在一些实施例中，本公开提供了在受试者的背根神经节(drg)中表达多肽的方法，其包括向受试者施用如本文所述的hsv mckrae株载体。在一些实施例中，载体在体内施用。在一些实施例中，载体通过与皮肤接触来施用。在一些实施例中，载体通过皮内注射来施用。

25、在一些实施例中，本公开提供了测量hsv mckrae株病毒载体在背根神经节(drg)中的转导效率的方法，其包括(a)使动物的皮肤与hsv mckrae株病毒载体接触，(b)从动物中取出drg组织，和(c)测定drg中转导的hsv基因组的数目。在一些实施例中，通过扩增技术测量基因组的数目。在一些实施例中，通过定量聚合酶链反应(pcr)测量基因组的数目。

26、在一些实施例中，本公开提供了测量hsv mckrae株病毒载体在背根神经节(drg)中的转导效率的方法，所述病毒载体含有包含多肽有效负载的表达盒，所述方法包括以下步骤：(a)使动物的皮肤与hsv mckrae株病毒载体接触，(b)从动物中取出drg组织，和(c)测定由表达盒的核酸编码的多肽的量。在一些实施例中，通过免疫测定来测量多肽的量。在一些实施例中，通过酶联免疫吸附测定(elisa)来测量多肽的量。

1.一种单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由seq id no:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质。

2.一种单纯疱疹病毒mckrae株的变体，其具有总体尺寸小于约150,000个碱基对的截短基因组，并且包括在对应于seq id no:1的残基126049至130014的元件内的一个或多个残基的缺失。

3.一种包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体，所述基因组含有改变，使得所述变体不能表达由seq id no:2的氨基酸序列表征的功能性蛋白质。

4.根据权利要求3所述的载体，其中所述载体包含神经元特异性启动子。

5.根据权利要求4所述的载体，其中所述神经元特异性启动子是降钙素基因相关肽(cgrp)启动子。

6.根据权利要求3-6中任一项所述的载体，其中所述载体包含人巨细胞病毒(hcmv)增强子。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的载体，其中所述载体包含牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的载体，其还包含编码治疗性多肽的核酸。

9.一种细胞，其用根据权利要求3-8中任一项所述的载体进行转导。

10.一种药物组合物，其包含根据权利要求3-8中任一项所述的载体和药学可接受的载体。

11.一种繁殖包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体的方法，所述基因组包含改变，使得所述变体不能表达由seq id no:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质，所述方法包括以下步骤：

12.根据权利要求11所述的方法，其还包括通过色谱纯化上清液中的载体的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其还包括通过切向流过滤而浓缩所述纯化的载体的步骤。

14.一种制备包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体的方法，所述基因组包含改变，使得所述变体不能表达由seq id no:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质，并且其中所述载体表达标记物元件，所述方法包括温育用以下转染的细胞：

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞是icp4互补细胞。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述标记物元件是多肽。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多肽通过荧光可检测。

18.根据权利要求15所述的方法，其还包括纯化表达标记物元件的病毒噬斑的步骤。

19.一种制备包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体的方法，所述基因组包含改变，使得所述变体不能表达由seq id no:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质，并且其中所述载体表达目的试剂，所述方法包括温育用以下转染的细胞：

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞是icp4互补细胞。

21.根据权利要求20所述的方法，其还包括纯化不表达标记物元件的病毒噬斑的步骤。

22.一种在受试者的背根神经节中表达多肽的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求8所述的载体。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述载体在体内施用。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述载体通过与皮肤接触来施用。

25.根据权利要求22所述的方法，其中所述载体通过皮内注射来施用。