一种高纯度脱氧核苷三磷酸单体的液相制备分离纯化方法与流程

本申请涉及化合物纯化，具体设计一种利用高压液相制备脱氧核苷三磷酸单体的方法。

背景技术：

1、脱氧核苷三磷酸(dntp)包括脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸，在生物化学和分子生物学领域中脱氧核苷三磷酸(dntp)具有各种用途，例如pcr聚合酶链式反应以及ivt体外转录，都需要高纯度的脱氧核苷三磷酸单体作为原料。随着高保真序列需求的逐渐加强，市场对这四种高纯度脱氧核苷三磷酸的需求量将会明显地增加。

2、现有技术中，对脱氧核苷单磷酸(dnmp)合成脱氧核苷三磷酸(dntp)的生物合成反应液，或采用沉降操作使生成的dntp以钡盐的形式被分离出来，再使用离子交换树脂分离提纯dntp；或者将dntp的生物合成反应液直接用离子交换树脂填充柱洗脱，再用高压液相色谱分离提纯的方法手段。总之对高纯度(纯度大于95％)dntp的分离提纯主要使用高压制备液相色谱进行分离。

3、现有技术中，利用高压制备液相制备dntp一般采用离子对试剂作为流动相，分离模式以反相模式为主导，或者采用盐溶液为流动相，分离模式以阴离子交换模式为主导，均存在分离效果差，分离速度慢，流动性溶剂消耗量过大的问题，无法满足大批量工业化生产的需求。

技术实现思路

1、本申请中所述碱金属盐是指钠盐或钾盐。

2、本申请中，制备液相的流动相b也称为洗脱剂。

3、本申请中上样量可根据粗品浓度与进样体积进行计算。

4、为了解决上述技术问题，本申请提供一种利用高压制备液相纯化并制备高纯度脱氧核苷三磷酸单体的方法，具体的本方法可以概括为：

5、流动相a以teaa或teab作为离子对试剂的同时加入碱金属盐，所述碱金属盐为碱金属盐或钾盐中的一种或多种，且碱金属盐的浓度为0.2～0.4％；流动相b为甲醇、乙醇、乙腈或四氢呋喃中的一种或多种；制备液相柱为反向色谱柱。

6、通过采用以上技术方案，流动相a的以teaa/teab作为离子对试剂，可以有效增加目标化合物的保留时间，碱金属盐的加入，进一步增加了离子交换模式，增大了目标化合物与附近杂质的分离度(分离度从0到分离度1.7)，在没有碱金属盐加入时，得到的dgtp的纯度只有95％左右，和上样前只提高了2％，而当加入碱金属盐后，以氯化钠为代表的碱金属盐制备得到的dgtp的纯度能够达到98.5％，而以碳酸钠(钾)或碳酸氢钠(钾)制备得到的dgtp的纯度高于99％同时碱金属盐的引入也增加了dntp系列分子在水中的溶解度；从而提高了上样量，即提高了粗品的浓度，这是因为当粗品浓度高达45g/l时，纯度依然大于99％。以上数据均具有统计学意义。

7、流动相b以甲醇、乙腈、乙醇或四氢呋喃中的一种或多种为洗脱剂；优选的采用甲醇、乙腈或乙醇中的一种或多种作为洗脱剂，最为优选的采用甲醇作为洗脱剂。

8、采用以上优选技术方案，可以有效增加对于碱金属盐的溶解度，并且增加了方法的兼容性，最终导致dntp在此分离条件下，分离度和上样量都有了明显的提高，例如甲醇同乙醇相比，以甲醇作为流动相b，粗品纯度为75％时，制备得到的dgtp仍高于99％，而乙醇不高于99％；又或者例如当粗品浓度高达45g/l时，以甲醇作为流动相b，制备得到的dgtp仍高于99％，而此时如果用乙腈或乙醇要么收率低于甲醇要么纯度低于甲醇。因此采用以上优选技术方案解决了单一teaa/teab作为离子对流动相，主峰与紧邻杂质(紧邻杂质指前杂和后杂)无法有效分离的问题；经分析以上结果，甲醇作为最优实施方案可能不仅仅与流动相b的极性有关，这是因为如果说甲醇相对于乙醇或四氢呋喃而言，在以反向色谱柱作为制备柱的基础上，优先选择极性更强的甲醇可以得到合理的解释，但是甲醇的极性要弱于乙腈的极性，而实验结果甲醇同乙腈相比，甲醇能可以显著提高碱金属盐的溶解度，增加了方法的兼容性，最终导致dntp在此种分离条件下，分离度和上样量都有了明显的提高。而采用乙腈作为流动相b，使的dgtp及其杂质出锋时间前移，且拖尾严重，为得到99％以上的dgtp需要损失部分收率，制备相同浓度和纯度的dgtp，流动相b采用乙腈比甲醇收率降低3％，具有统计学上的显著性差异，即甲醇作为洗脱剂的洗脱效果出乎意料的优于乙腈的洗脱效果。

9、本申请高压制备液相用流动相为，在常用teaa/teab流动相的基础上，采用碱金属盐增加流动相中离子浓度；所述碱金属盐为氯化钠、碳酸钠(钾)、碳酸氢钠(钾)、氯化钾、硝酸钠(钾)、溴化钠(钾)、硫酸钠(钾)或硫酸氢钠(钾)等；优选的所述碱金属盐为碳酸根或碳酸氢根碱金属盐，例如碳酸钠(钾)、碳酸氢钠(钾)。

10、通过采用以上技术方案，碱金属盐可以增大目标化合物与附近杂质的分离度，同时碱金属盐的引入也增加了dntp系列分子在水中的溶解度，从而显著提高了高压制备液相的上样量，即有利于大批量制备dntp，更适合工业化生产。并且氯化钠(钾)、磷酸钠(钾)、磷酸一氢钠(钾)或磷酸二氢钠(钾)硝酸钠(钾)、溴化钠(钾)、硫酸钠(钾)或硫酸氢钠(钾)等，因为其酸根离子不好去除，且分离度出现了出乎意料的弱于碳酸钠(钾)或碳酸氢钠(钾)。在筛选流动相a中盐的种类实验中，以氯化钠为代表的dgtp的纯度最高不超过99％，而在流动相a中加入碳酸钠(钾)或碳酸氢钠(钾)，并且它们的浓度在0.2％至0.4％之间，制备得到的dgtp的纯度均在99％以上；即流动相a中加入碳酸钠(钾)或碳酸氢钠(钾)比其他碱金属盐制备得到的dgtp的纯度高1个百分点，且具有统计学上的显著性。

技术特征：

1.一种脱氧核苷三磷酸单体的制备方法，该方法是指高压液相制备方法，其特征在于，所述高压液相的流动相a以teaa或teab作为离子对试剂的同时加入碱金属盐，所述碱金属盐为碱金属钠盐或钾盐中的一种或多种，且碱金属盐的浓度为0.2~0.4%；高压液相的流动相b为甲醇、乙腈、乙醇或四氢呋喃中的一种或多种；制备液相柱为反向色谱柱。

2.根据权利要求1所述的脱氧核苷三磷酸单体的制备方法，其特征在于，所述碱金属盐为钠盐或钾盐，所述钠盐为氯化钠、磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸钠、硝酸钠、溴化钠、硫酸钠、硫酸氢钠中的一种或多种；所述钾盐为氯化钾、碳酸氢钾、碳酸钾、硝酸钾、溴化钾、硫酸钾或硫酸氢钾中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2任意一项所述的脱氧核苷三磷酸单体的制备方法，其特征在于，所述碱金属盐为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、或碳酸氢钾中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的脱氧核苷三磷酸单体的制备方法，其特征在于，所述流动相a中离子对浓度在100 mm±5 mm至150 mm±5 mm之间。

5.根据权利要求1所述的脱氧核苷三磷酸单体的制备方法，其特征在于，所述流动相b为甲醇、乙腈或乙醇中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的脱氧核苷三磷酸单体的制备方法，其特征在于，流动相a以二氧化碳或氢氧化钠调节ph，将流动相a的ph调节到7.0~7.5。

7.根据权利要求1所述的脱氧核苷三磷酸单体的制备方法，其特征在于，洗脱剂采用梯度洗脱，所述梯度为甲醇梯度由0%提升到30±2%，并在30±2%维持10 min以上。

8.根据权利要求1所述的脱氧核苷三磷酸单体的制备方法，其特征在于，所述高压制备液相的制备液相柱采用动态轴向压缩柱dac-50，填料选用c18-100-8所述高压制备液相的流动相流速为15±2 ml/min。

9.根据权利要求1所述的脱氧核苷三磷酸单体的制备方法，其特征在于，所述脱氧核苷三磷酸单体粗品上样浓度不高于45g/l。

10.根据权利要求1所述的脱氧核苷三磷酸单体的制备方法，其特征在于，所述脱氧核苷三磷酸单体粗品纯度在大于等于75%小于100%。

技术总结
本申请涉及脱氧核苷三磷酸单体的制备方法，具体公开了一种利用高压制备液相制备高纯度脱氧核苷三磷酸单体方法。该方法流动相A以TEAA或TEAB作为离子对试剂的同时加入碱金属盐，所述碱金属盐为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、或碳酸氢钾中的一种或多种，且碱金属盐的浓度为0.2~0.4%；流动相B为甲醇、乙腈、乙醇或四氢呋喃中的一种或多种；制备液相柱为反向色谱柱。

技术研发人员：郭一琼,肖川,公绪芳,宋艳民
受保护的技术使用者：天津全和诚科技有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15