一种检测生物体内羧酸酯酶2的生物发光探针及其制备方法和用途

本发明属于生物检测，具体涉及一种检测生物体内羧酸酯酶2的生物发光探针及其制备方法和用途。

背景技术：

1、生物发光是一种自然界普遍存在的，依赖于生物正常生命活动的化学发光。其本质是酶和底物之间的相互作用，经过一系列生物反应产生化学能，并以光能的形式释放出来。生物发光成像是利用生物体内酶催化的化学反应产生光子的原理进行的。最常见的生物发光体系是萤火虫萤光素酶(luciferase)-萤光素(luciferin)系统，其实质是萤火虫萤光素酶在能量(atp)及氧存在的条件下催化底物萤光素，发生电子跃迁，分子由激发态回到稳态时产生光子，并释放氧化性萤光素(oxyluciferin)。生物发光成像技术凭借其高灵敏性、高生物相容性以及可视化等特点已经成为很重要的检测的手段，被广泛应用于各个领域。

2、羧酸酯酶(carboxylesterases，ce)作为体内重要的ⅰ相药物代谢酶，隶属于酯酶家族，广泛存在于哺乳动物细胞中，主要催化酯键、酰胺键、硫酯键等水解，参与多种酯类药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢。在人体中，羧酸酯酶主要包括羧酸酯酶1(ce1)和羧酸酯酶2(ce2)两个亚型，二者在组织分布和底物特异性上存在显著差异。ce2在许多癌细胞中高表达，ce2在介导许多原药如吉西他滨、伊立替康(cpt11)和卡培他滨(cape)的激活过程中起作用。此外，ce2被认为是肠道第一道代谢的重要决定因素，特别是对于口服抗癌原药。鉴于ce2在各种抗癌原药代谢中的关键作用，开发合适的技术在复杂的生理条件下准确、灵敏地检测ce2是相当必要的。

技术实现思路

1、为了解决现有羧酸酯酶2光学探针选择性差、灵敏度低和条件苛刻的问题，本发明提供了一种检测生物体内羧酸酯酶2的生物发光探针及其制备方法和用途。本发明提供的生物发光探针对羧酸酯酶2具有高选择性和超高灵敏度，可以实现高选择性、高灵敏度地定性、定量分析检测羧酸酯酶2。

2、本发明提供了一种化合物、或其盐、或其立体异构体，所述化合物的结构如式cbp所示：

3、

4、本发明还提供了前述的化合物的制备方法，它包括如下步骤：

5、

6、(1)溶剂中，化合物1和化合物2在碱作用下反应，得到化合物3；

7、(2)溶剂中，化合物3和d-半胱氨酸盐酸盐在碱作用下反应，得到化合物cbp。

8、进一步地，

9、步骤(1)中，所述溶剂为无水二氯甲烷；

10、和/或，步骤(1)中，所述碱为三乙胺；

11、和/或，步骤(2)中，所述溶剂为二氯甲烷、无水甲醇和水的混合溶液；

12、和/或，步骤(2)中，所述碱为碳酸钾。

13、进一步地，

14、步骤(1)中，化合物1溶于无水二氯甲烷中，再加入含化合物2和碱的无水二氯甲烷溶液，反应，得到化合物3；

15、和/或，步骤(2)中，化合物3溶于二氯甲烷和无水甲醇混合溶液中，加入含碱和d-半胱氨酸盐酸盐的无水甲醇和水混合溶液，反应，得到化合物cbp。

16、进一步地，

17、步骤(2)中，所述二氯甲烷和无水甲醇混合溶液中，二氯甲烷和无水甲醇的体积比为1:1；

18、和/或，步骤(2)中，所述无水甲醇和水混合溶液中，无水甲醇和水的体积比为1:1。

19、进一步地，

20、步骤(1)中，所述化合物1、化合物2和碱的摩尔比为1：1～5：1～5；

21、和/或，步骤(1)中，所述反应的温度为0℃～40℃，时间为4～10h；

22、和/或，步骤(2)中，所述化合物3和d-半胱氨酸盐酸盐的摩尔比为1:1～5；

23、和/或，步骤(2)中，所述化合物3和碱的质量比为1:1～2；

24、和/或，步骤(2)中，所述反应的温度为20℃～30℃，时间为1～2h。

25、进一步地，

26、步骤(1)中，所述化合物1、化合物2和碱的摩尔比为1：2.5：2.5；

27、和/或，步骤(1)中，所述反应现在0～4℃反应1～3h，然后在25～40℃反应5～6h；

28、和/或，步骤(2)中，所述化合物3和d-半胱氨酸盐酸盐的摩尔比为1:2；

29、和/或，步骤(2)中，所述化合物3和碱的质量比为1:1.2～1.3。

30、进一步地，

31、步骤(1)中，所述反应后将反应液进行纯化得到化合物3，所述纯化的步骤为将反应液旋干、萃取、干燥、过滤、旋干、柱层析分离，所述柱层析分离使用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯体积比9:1的混合溶液；

32、和/或，步骤(2)中，所述反应后将反应液进行纯化得到化合cbp，所述纯化的步骤为将反应液旋干、加入水，用盐酸调节ph至1，析出固体，过滤。

33、本发明还提供了前述的化合物、或其盐、或其立体异构体在制备生物发光探针中的用途。

34、进一步地，所述生物发光探针为检测羧酸酯酶2的生物发光探针；

35、优选地，所述生物发光探针为检测生物体内羧酸酯酶2的生物发光探针。

36、本发明以2-噻吩甲酰基为识别基团，羟基荧光素为生物发光基团合成了新型检测羧酸酯酶2的生物发光探针cbp。该生物发光探针制备方法简单、收率高、成本低。羧酸酯酶2可与该探针中的酯基作用，从而酯基断裂，释放出羟基荧光素，在atp、萤光素酶、mg2+等作用下产生强生物发光，生物发光信号较稳定，并且生物发光强度与羧酸酯酶2浓度在一定范围内呈优良的线性关系，可作为羧酸酯酶2定性、定量检测的依据。

37、与现有技术相比，本发明技术方案的优势如下：

38、本发明提供的检测生物体内羧酸酯酶2的生物发光探针生物相容性好，与羧酸酯酶2反应速度快，选择性强，对其他干扰离子几乎没有响应，检测灵敏度高，响应性好，检测限低，生物发光强度与羧酸酯酶2在一定浓度范围内呈线性关系，且生物发光信号稳定，可用于对羧酸酯酶2进行定性、定量检测，具有广泛的应用前景。

39、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

40、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种化合物、或其盐、或其立体异构体，其特征在于：所述化合物的结构如式cbp所示：

2.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

9.权利要求1所述的化合物、或其盐、或其立体异构体在制备生物发光探针中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述生物发光探针为检测羧酸酯酶2的生物发光探针；

技术总结
本发明提供了一种检测生物体内羧酸酯酶2的生物发光探针及其制备方法和用途，属于生物检测技术领域。本发明生物发光探针是式CBP所示的化合物、或其盐、或其立体异构体。本发明提供的检测生物体内羧酸酯酶2的生物发光探针生物相容性好，与羧酸酯酶2反应速度快，选择性强，对其他干扰离子几乎没有响应，检测灵敏度高，响应性好，检测限低，生物发光强度与羧酸酯酶2在一定浓度范围内呈线性关系，且生物发光信号稳定，可用于对羧酸酯酶2进行定性、定量检测，具有广泛的应用前景。

技术研发人员：柯博文,陈梅远,赵甜甜,陈宇豪,海澳,胡世龙
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16