一种外切木聚糖酶及其编码基因和应用

本发明涉及来源于生孢噬纤维菌(sporocytophagasp.)的外切木聚糖酶及其编码基因与应用，属于生物工程。

背景技术：

1、木质纤维素在自然界中含量丰富，是可持续利用的生物质资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中纤维素和半纤维素是木质纤维素生物质中第一和第二大的组分。

2、木聚糖是半纤维素的主要成分，是自然界中含量第二丰富的多糖，约占地球上所有可再生有机碳资源的三分之一。在生物炼制过程中，生物废料中的木聚糖应首先通过化学、物理或酶法降解为单糖。其中，酶解法是最绿色环保的一种，在工业上有很大的应用潜力，在一定程度上破坏木质纤维素的结构，可以加快木聚糖酶的分解速度。木聚糖的完全降解需要几种木聚糖酶的协同反应，主要包括内切木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanase，ec3.2.1.8)、外切木聚糖酶(reducing-end-xylose releasing exo-oligoxylanase，ec3.2.1.156)及β-木糖苷酶(β-xylosidase，ec 3.2.1.37)，其中目前研究较多的为内切木聚糖酶及β-木糖苷酶，有关外切木聚糖酶的文献鲜有报道。

3、木聚糖酶广泛应用于食品、动物饲料、造纸和制浆以及生物燃料等行业。在食品工业中，木聚糖酶用于制作面包和酿造啤酒，木聚糖酶可改善面包品质，提高啤酒发酵效率。在动物饲料工业中，木聚糖酶可提高猪等牲畜的饲料消化率。在造纸和制浆工业中，木聚糖酶可以增强漂白效果，减少环境污染。木聚糖酶的酶解产物低聚木糖，是一种有效的益生元，可以通过刺激以双歧杆菌和乳酸杆菌为主的肠道菌群的生长而有益于人体健康。因此，发现在较宽的ph范围内具有较高活性、热稳定性和所需特异性的新型木聚糖酶对现代生物技术应用具有重要意义。

4、生孢噬纤维菌是一种常见的好氧性纤维素分解细菌，其靠滑动附着于不溶性固体介质的表面获得养分，生成大量的胞外多糖。

5、本发明所涉及的木聚糖酶为外切木聚糖酶，较其他报道的碱性木聚糖酶有更强的耐碱性(汪俊卿.一种耐热耐碱木聚糖酶及应用:114438057[p].2022-05-06)，报道的高比活木聚糖酶酶活力为905.8u/mg，本发明所涉及的外切木聚糖酶具有更高的酶活力(吴秀秀.高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用:115960868[p].2023-04-14)且产物以可被双歧杆菌及乳酸杆菌利用的木二糖、木三糖为主(王魁.一种特异性产生木寡糖的木聚糖酶bgxyn8a及其基因与应用:115491366[p].2022-12-20)。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供一种新型碱性外切木聚糖酶及其编码基因与应用。

2、一种外切木聚糖酶smrex8a，氨基酸序列如seq id no.2所示。

3、对外切木聚糖酶smrex8a进行氨基酸序列分析，其分子量为75.5kda。该酶对榉木木聚糖、燕麦木聚糖、甘蔗渣木聚糖、玉米芯木聚糖、β-大麦葡聚糖具有活性，且对榉木木聚糖活性最高，高达1613u/mg。后续以榉木木聚糖为底物对其进行酶学性质研究以及产物分析，其最适温度为35℃，最适ph为7.5，水解榉木木聚糖产物主要为低聚木糖，以木二糖、木三糖为主，含有少量木糖。

4、上述外切木聚糖酶的编码基因smrex8a，核苷酸序列如seq id no.1所示。其第286-1224个碱基组成的核苷酸序列为外切木聚糖酶的催化结构域核苷酸序列。其第1539-2100个碱基组成的核苷酸序列为外切木聚糖酶的碳水化合物结合模块核苷酸序列。

5、编码基因smrex8a进行异源表达，获得活性蛋白。编码基因smrex8a装载在pet28a载体上得到重组质粒，然后转入到大肠杆菌e.coli bl21(de3)宿主中得到工程菌。该重组工程菌株经过发酵培养，超声破碎，镍柱亲和层析柱(ni-nta)纯化后能够得到了大量活性木聚糖酶smrex8a。

6、可用于降解木聚糖进行低聚木糖的生产。

7、发明有益效果

8、本发明所述外切木聚糖酶smrex8a，属于gh8家族，分子量为75.5kda，容易进行异源表达，表达量较高，获得具有高催化活性蛋白。smrex8a对榉木木聚糖、燕麦木聚糖、甘蔗渣木聚糖、玉米芯木聚糖等具有较强的水解能力，且水解榉木木聚糖的酶活力高达1613u/mg。本发明为产益生元低聚木糖提供了新的材料，smrex8a水解榉木木聚糖的水解产物以聚合度2-4的低聚木糖为主，含量可达90％。同时，smrex8a也具有较强的耐碱性，在ph6-11可保留60％以上活性(可称之为碱性外切木聚糖酶)，可应用于造纸脱墨等行业。因此，该酶在生物能源、饲料、造纸等行业具广泛的应用潜力。

技术特征：

1.一种外切木聚糖酶的编码基因，其特征在于，

2.一种权利要求1所述基因编码的外切木聚糖酶，其特征在于，

3.一种权利要求2所述的外切木聚糖酶在降解木聚糖过程中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述外切木聚糖酶可以降解榉木木聚糖、甘蔗渣木聚糖、燕麦木聚糖、玉米芯木聚糖等中的一种或二种以上。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：降解木聚糖时，反应温度适用范围25-65℃，优选范围25-50℃，最适反应温度30-40℃；反应ph适用范围ph 4.5-12，优选范围ph6.5-12，反应最适ph值为7-11。

6.根据权利要求3或4或5所述的应用，其特征在于，所述外切木聚糖酶降解木聚糖产物以低聚木糖为主，其聚合度为2-4，含量可达90％以上。

技术总结
本发明提供一种外切木聚糖酶及其编码基因与应用；外切木聚糖酶SmRex8A，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码基因SmRex8A，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。可用于降解木聚糖进行低聚木糖的生产。

技术研发人员：陈晓艺,庄迎,杨帆,俞志敏,李宪臻
受保护的技术使用者：大连工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16