DNAH3基因点突变小鼠模型的构建方法及试剂盒与流程

本申请属于动物模型，具体涉及一种dnah3基因点突变小鼠模型的构建方法及试剂盒。

背景技术：

1、近年来，不孕不育成为影响人类生理和心理健康的重大疾病之一，全球约15％的夫妇受其困扰，男性不育占比近一半。男性不育的表现具有异质性，包括了无精子症、少精子症，弱精子症，畸精子症或者多种症状的组合形式。其中，弱畸形精子症是导致男性不育的常见原因之一。遗传缺陷是导致弱畸形精子症的重要因素之一。随着高通量测序技术的发展，弱畸形精子症的致病基因陆续被报道，如纤毛和鞭毛相关蛋白(cfap)家族基因、卷曲螺旋结构域(ccdc)家族基因、轴丝动力蛋白重链(dnah)家族基因。这些蛋白的缺陷影响了精子鞭毛轴丝结构的正常组装，破坏了精子形态和活力，最终导致男性不育。

2、dnah家族蛋白是编码组装精子鞭毛轴丝上动力蛋白臂的重要分子。目前发现了dnah1-dnah3、dnah5-dnah12、dnah14和dnah17等13个dnah家族基因，其中有11个基因与男性不育有关。包括dnah1、dnah2、dnah6、dnah7、dnah8、dnah10和dnah17在内的7个基因导致了弱畸形精子症发生。

3、但是目前关于dnah3是否导致男性不育伴弱畸形精子症仍然未知。在手段上，由于患者精子标本稀少，获取困难，无法进行深入研究，缺乏有效的能够模拟患者所携带的dnah3突变位点的dnah3基因敲入模型来进一步分析该基因的功能。

技术实现思路

1、基于此，本申请提供一种dnah3基因点突变小鼠模型的构建方法以解决目前缺乏有效的能够模拟患者所携带的dnah3突变位点模型的技术问题。

2、本申请一方面提供一种dnah3基因点突变模型的构建方法，包括以下步骤：

3、(1)设计靶向小鼠dnah3基因35号外显子c.5044_5045(p.1682)位置的sgrna与同源修复模板donor dna；所述sgrna的序列如seq id no.1所示；所述模板donor dna的序列如seq id no.2所示；

4、(2)采用sgrna构建sgrna/cas9表达载体，体外转录，制备mrna；

5、(3)将所述mrna以及所述donor dna引入小鼠受精卵，获得f0代小鼠；以及，

6、(4)从所述f0代小鼠中筛选dnah3基因点突变稳定的小鼠遗传系，将阳性f0代小鼠与野生小鼠杂交得到f1代杂合子小鼠，再将f1代杂合子小鼠交配得到稳定遗传变异的f2代dnah3点突变纯合小鼠。

7、在其中一个实施例中，pcr检测所使用的引物如seq id no.3和seq id no.4所示。

8、在其中一个实施例中，构建sgrna/cas9表达载体中载体选自px260、px459或px458。

9、本申请另一方面提供一种dnah3基因点突变模型的构建方法，构建sgrna/cas9表达载体中启动子选自t7启动子或sp6启动子。

10、在其中一个实施例中，步骤(3)显微注射还包括4μg/ml～6μg/ml的松弛剂。

11、在其中一个实施例中，所述小鼠品系选自c57bl/6或dba/2。

12、本申请还提供一种构建dnah3基因点突变模型的试剂盒，含有sgrna以及对应的引物和同源修复模板donor dna，所述的sgrna序列如seq id no.1所示，donor序列如seq idno.2所示，引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示。

13、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括cas9mrna。

14、在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括pcr反应缓冲液和pcr反应液中的一种或多种。

15、在其中一个实施例中，所述pcr反应液包括taq dna聚合酶、dntps和mg2+中的一种或多种。

16、相对于传统技术，本申请的有益效果包括：

17、本申请设计的grna靶向突变位点(c.5044)能够模拟患者(p1)所携带的突变位点c.g5143a(p.g1682s)的dnah3基因敲入小鼠模型，通过精准靶向dnah3基因35号外显子的p.g1682s突变，精准模拟了dnah3患者突变位点，从而构建出了有效的能够模拟患者所携带的dnah3突变位点的小鼠模型。对于深入分析该突变的致病性，研究dnah3基因的具体功能，探讨相关的致病机制，并为临床上该类基因缺陷患者的治疗提供理论基础等方面具有重要意义。

技术特征：

1.一种dnah3基因点突变模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的dnah3基因点突变模型的构建方法，其特征在于，pcr检测所使用的引物如seq id no.3和seq id no.4所示。

3.根据权利要求1～2任一项所述的dnah3基因点突变模型的构建方法，其特征在于，构建sgrna/cas9表达载体中载体选自px260、px459或px458。

4.据权利要求1～2任一项所述的dnah3基因点突变模型的构建方法，其特征在于，构建sgrna/cas9表达载体中启动子选自t7启动子或sp6启动子。

5.根据权利要求4所述的dnah3基因点突变模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)显微注射还包括4μg/ml～6μg/ml的松弛剂。

6.根据权利要求5所述的dnah3基因点突变模型的构建方法，其特征在于，小鼠品系选自c57bl/6或dba/2。

7.一种构建dnah3基因点突变模型的试剂盒，其特征在于，含有sgrna以及对应的引物和同源修复模板donor dna，所述的sgrna序列如seq idno.1所示，donor序列如seq idno.2所示，引物序列如seq id no.3和seqid no.4所示。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas9mrna。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应缓冲液和pcr反应液中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应液包括taqdna聚合酶、dntps和mg2+中的一种或多种。

技术总结
本申请属于动物模型技术领域，具体涉及一种DNAH3基因点突变模型的构建方法。精准靶向DNAH3基因35号外显子的p.G1682S突变，模拟了DNAH3患者突变位点。后续通过杂合子小鼠繁育，可不断配出DNAH3纯合点突变小鼠，作为后续DNAH3基因功能实验的工具小鼠。对于深入分析该突变的致病性，研究DNAH3基因的具体功能，探讨相关的致病机制，并为临床上该类基因缺陷患者的治疗提供理论基础等方面具有重要意义。

技术研发人员：何文斌,孟桂全,谭跃球,杜娟,蒙岚岚,谭琛,林戈
受保护的技术使用者：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16