一种小细胞肺癌类器官专用培养液及其应用

本发明涉及生物医药，尤其是涉及一种小细胞肺癌类器官专用培养液及其应用。

背景技术：

1、小细胞肺癌(sclc)是一种起源于支气管黏膜上皮的kuchitsky细胞的异源性神经内分泌肿瘤,是肺癌中侵袭性最强的亚型，约占肺癌的15％-20％。98％的sclc归因于吸烟，其特点是恶性程度高、侵袭性很高、病情进展快、早期出现远处转移等。sclc目前的治疗方式主要有手术、化疗、放疗和尚未正式批准运用到临床的免疫及靶向治疗。由于sclc的临床特点,发现时已有远处转移,仅有约5％的sclc患者能够早期发现并能完成手术治疗，而且手术治疗仅适用于临床分期i期(t1-2,n0)并且纵隔淋巴结未被侵犯的局限期sclc患者。肿瘤切除后推荐辅助化疗或者放化疗联合治疗，但是大部分患者很快原位复发或远处转移，5年生存率仅为10％。药物辅助治疗存在方案多样化，药物效率不高，易产生耐药，试药程序复杂等问题。

2、类器官(organoid)是一种利用成体干细胞，在体外培养出的3d细胞培养物，与对应的人体器官具有高度相似的组织学特征，能重现器官的部分生理功能。利用患者离体肿瘤组织构建类器官能模拟肿瘤组织的发生过程及生理病理状态，因此，可作为研究小细胞肺癌的病理生物学特性以及用于(个性化)药物筛选的先进工具，在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。

3、目前，已有肺癌类器官培养技术，然而，主要是针对非小细胞肺癌类器官培养，对于恶性程度高、侵袭性强、神经内分泌型的小细胞肺癌类器官培养较少见。鉴于此，有必要开发一种专用于构建小细胞肺癌类器官培养的培养液。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种小细胞肺癌类器官专用培养液及其应用。

2、本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：

3、一种小细胞肺癌类器官专用培养液，每10ml所述小细胞肺癌类器官专用培养液由如下原料制成：hepes缓冲液，ph＝7.2～7.4，终浓度为8～10mm；antibiotic-antimycotic，终浓度为50～100μg/ml；b27，终浓度为1～2％v/v；n2，终浓度为1～2％v/v；glutamax，1～2％v/v；a83-01，终浓度为0.1～0.5μm；egf，终浓度为10～20ng/ml；bfgf，终浓度为10～20ng/ml；r-spondin1，终浓度为50～100ng/ml；n-cetylcysteine，终浓度为0.5～2mm；sb203580，终浓度为0.5～2μm；wnt3a，终浓度为50～100ng/ml；afamin，终浓度为50～100ng/ml；fli-06，终浓度为2～10μm；y-27632，终浓度为8～10μm；用dmem/f12培养基补足至10ml。

4、优选的，每10ml上述小细胞肺癌类器官专用培养液由如下原料制成：hepes缓冲液，ph＝7.2～7.4，终浓度为10mm；antibiotic-antimycotic，终浓度为100μg/ml；b27，终浓度为1％v/v；n2，终浓度为1％v/v；glutamax，终浓度为1％v/v；a83-01，终浓度为0.5μm；egf，终浓度为20ng/ml；bfgf，终浓度为20ng/ml；r-spondin1，终浓度为100ng/ml；n-cetylcysteine，终浓度为1mm；sb203580，终浓度为1μm；wnt3a，终浓度为100ng/ml；afamin，终浓度为100ng/ml；fli-06，终浓度为10μm；y-27632，终浓度为10μm；用dmem/f12培养基补足至10ml。

5、上述一种小细胞肺癌类器官专用培养液在小细胞肺癌类器官培养中的应用。

6、一种利用上述小细胞肺癌类器官专用培养液培养小细胞肺癌类器官的方法，包括以下步骤：

7、1)获得小细胞肺癌肿瘤组织，机械及酶解消化小细胞肺癌肿瘤组织，细胞筛网过滤后离心，收集细胞沉淀用小细胞肺癌类器官专用培养液重悬，得到小细胞肺癌细胞重悬液；

8、2)将小细胞肺癌细胞重悬液与基质胶混合后滴胶接种于24孔板中，待胶滴全凝固后加入小细胞肺癌类器官专用培养液，培养获得小细胞肺癌类器官；培养时2天换液一次，培养7天后传代。

9、一种由上述方法培养获得的小细胞肺癌类器官。

10、上述一种小细胞肺癌类器官在筛选预防或治疗小细胞肺癌的药物中的应用。

11、本发明提供的一种小细胞肺癌类器官专用培养液中，hepes可调节培养基ph值；b27是细胞生长所需营养因子，可促进细胞存活和生长；n2可促进类器官的生长活性；glutamax可提高类器官活性，改善生长状况；egf、bfgf可促进细胞生长、增殖、分化，从而促进类器官生长；r-spondin 1(wnt信号通路激活剂)可促进肿瘤干细胞的自我更新；n-cetylcysteine具有抗氧化作用；wnt3a可以促进肿瘤干细胞生长、增殖、分化和抑制凋亡的效果；afamin可与wnt3a结合形成复合体，提高wnt3a的稳定性，维持其较高活性，两者联用可以更适用于类器官的长期培养；sb203580可抑制肿瘤干细胞凋亡与衰老；y-27632具有抑制干细胞凋亡及分化的作用；特别添加fli-06，其可以靶向抑制notch信号通路，进而促进小细胞肺癌的增殖，发挥与delta样配体3(dll3)类似的作用(在小细胞肺癌中，dll3可通过抑制notch信号通路激活p13k/akt通路，参与wnt信号通路的激活，促进小细胞肺癌的发展)，有助于小细胞肺癌类器官的构建。

技术特征：

1.一种小细胞肺癌类器官专用培养液，其特征在于：每10ml所述小细胞肺癌类器官专用培养液由如下原料制成：hepes缓冲液，ph=7.2~7.4，终浓度为8~10 mm；antibiotic-antimycotic，终浓度为50~100 μg/ml；b27，终浓度为1~2% v/v；n2，终浓度为1~2% v/v；glutamax，1~2% v/v；a83-01，终浓度为0.1~0.5 μm；egf，终浓度为10~20 ng/ml；bfgf，终浓度为10~20 ng/ml；r-spondin1，终浓度为50~100 ng/ml；n-cetylcysteine，终浓度为0.5~2mm；sb203580，终浓度为0.5~2 μm；wnt3a，终浓度为50~100 ng/ml；afamin，终浓度为50~100ng/ml；fli-06，终浓度为2~10 μm；y-27632，终浓度为8~10 μm；用dmem/f12培养基补足至10ml。

2.根据权利要求1所述的小细胞肺癌类器官专用培养液，其特征在于：每10ml所述小细胞肺癌类器官专用培养液由如下原料制成：hepes缓冲液，ph=7.2~7.4，终浓度为10 mm；antibiotic-antimycotic，终浓度为100 μg/ml；b27，终浓度为1% v/v；n2，终浓度为1% v/v；glutamax，终浓度为1% v/v；a83-01，终浓度为0.5 μm；egf，终浓度为20 ng/ml；bfgf，终浓度为20 ng/ml；r-spondin1，终浓度为100 ng/ml；n-cetylcysteine，终浓度为1 mm；sb203580，终浓度为1 μm；wnt3a，终浓度为100 ng/ml；afamin，终浓度为100 ng/ml；fli-06，终浓度为10 μm；y-27632，终浓度为10 μm；用dmem/f12培养基补足至10 ml。

3.如权利要求1所述的小细胞肺癌类器官专用培养液在小细胞肺癌类器官培养中的应用。

4.一种小细胞肺癌类器官的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的小细胞肺癌类器官的培养方法，其特征在于：步骤2）中培养时2天换液一次，培养7天后传代。

6.一种由权利要求4所述的培养方法获得的小细胞肺癌类器官。

7.如权利要求6所述的小细胞肺癌类器官在筛选预防或治疗小细胞肺癌的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种小细胞肺癌类器官专用培养液及其应用。所述小细胞肺癌类器官专用培养液由HEPES缓冲液、Antibiotic‑Antimycotic、B27、N2、Glutamax、A83‑01、EGF、bFGF、R‑spondin1、N‑cetylcysteine、SB203580、Wnt3a、Afamin、FLI‑06、Y‑27632和DMEM/F12培养基组成。所述FLI‑06在小细胞肺癌类器官专用培养液中的终浓度为2~10μM，该特定浓度的FLI‑06能够特异、有效促进小细胞肺癌类器官的体外生长。本发明提供的小细胞肺癌类器官专用培养液可实现患者来源小细胞肺癌类器官的成功构建，并可实现长期稳定培养，可为小细胞肺癌的发生发展机制研究、药物药敏检测研究等提供一个理想的模型。

技术研发人员：卢钟磊,刘远玲,梁虹,庄明智,刘慧洁
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16