一株假诺卡氏菌及其应用

本发明属于微生物，涉及一株假诺卡氏菌及其应用。

背景技术：

1、噻虫嗪是一种新烟碱类杀虫剂，与吡虫啉具有相似的作用机理，即作为烟碱乙酰胆碱受体(nachr)激动剂与乙酰胆碱受体选择性结合，阻断中枢神经正常传导，导致神经过度刺激。中毒昆虫表现出抽搐、麻痹和最终死亡的症状。噻虫嗪不仅具有触杀、胃毒、内吸活性等特点，还具有高效、安全、作用速度快、杀虫谱广以及持效期长等特点，广泛应用于水稻、小麦、棉花，可以有效防治同翅目、鞘翅目、双翅目和鳞翅目等害虫，也可以防治蚜虫科、粉虱科、蝉科、菊科、线虫、飞虱、粉蚧和植食性螨虫。但新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性为高毒或剧毒，且具有亚致死效应，其有效成分及代谢物在花粉和花蜜中残留，导致蜜蜂种群减少，存活与繁殖能力降低。

2、现有技术对农药污染治理的方法包括物理修复、化学修复和生物修复。虽然物理、化学的方法可以达到一定的效果，但其存在成本高、能耗大、环境不友好等问题。专利cn104312770a公开了高效农药残留降解剂，包括氢氧化钙、野菊花、甘草单钠盐、活性钙、碳酸氢钠、脂肪酸聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸钠、柠檬酸、聚醚改性硅油、柠檬酸钠、牛蒡子和芝麻油，能够将残留在作物上的农药分解、溶化，但是使用成本较高。

3、生物修复是利用生物的生命代谢活动来减少土壤环境中有毒有害物质的浓度或使其完全无害化，操作简单、处理费用低、效果好、并且能够就地进行处理，是治理农药污染的有效手段。专利cn110172430a公开了一株桑肠杆菌及其在降解噻虫嗪中的应用。专利cn110106116a公开了一株阴沟肠杆菌及其在降解噻虫嗪中的应用。现已有将生物修复技术应用于降解噻虫嗪，但是并未出现假诺卡氏菌降解新烟碱类杀虫剂的相关文献。

技术实现思路

1、为进一步推动生物修复技术在降解新烟碱类杀虫剂中的研究，本发明提供了一株假诺卡氏菌，该菌株及其培养液或是发酵液均能够针对噻虫嗪进行降解，本发明为防治新烟碱类杀虫剂造成的农药污染提供微生物资源。

2、为实现本发明的技术目的，一方面，本发明提供一株假诺卡氏菌pseudonocardiasp.qt-f-20，已于2023年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27343。其16s rdna序列如seq id no.1所示。

3、该菌株分离自宁夏银北岩石地衣中，通过梯度稀释、平板划线等方法分离纯化出单一微生物菌株。将单一微生物菌株接种于放线菌液体培养基中，28℃，180r/min摇床振荡培养。待菌株生长至对数生长期(第5d)，分别加入底物农药噻虫嗪至其浓度为50mg/l，同条件继续培养至5d，取样进行薄层色谱分析观察其对噻虫嗪的降解效果，筛选出对噻虫嗪具有降解作用的菌株。

4、进一步，本发明菌株qt-f-20为假诺卡氏菌(pseudonocardia sp)。

5、本发明通过将假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20接种于高氏一号培养基，于28℃下恒温培养5d后，得到培养基中菌落为淡黄色，表面干燥，菌落边缘带有少量白色，边缘不规则，菌落背面呈橙黄色。通过对假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20的生理生化试验，得知假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20不具有产生淀粉酶利用淀粉、分解含硫有机物、利用葡萄糖以及利用葡萄糖产酸、产生色氨酸酶、发酵乳糖产酸产气以及凝固的能力，具有产生过氧化氢酶、明胶酶(类蛋白水解酶)、卵磷脂酶的能力，也能过还原硝酸盐。通过对假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20的dna序列进行同源性比对分析，并挑选同源性较相关序列构建系统发育树，分析进化关系，得知菌株qt-f-20为假诺卡氏菌。

6、进一步，本发明所述假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20及其发酵液对新烟碱类杀虫剂具有降解作用。

7、本发明对假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20分解代谢产生的噻虫嗪降解产物进行鉴定，将纯化培养的假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20接种于150ml的放线菌液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养，至对数生长期(第5d)。加入农药底物噻虫嗪至其浓度为100mg/l，同条件继续培养7d。采用液相色谱质谱联用仪测定菌株的降解产物情况。所述降解产物包括脱硝基/胍/亚胺噻虫嗪、脲基噻虫嗪、胍基噻虫胺、n-(2-氯噻唑-5-基)甲基-n-羟甲基甲酰亚胺、噻虫嗪酸，还包括去甲基化胍基噻虫胺和羟基化脲基噻虫嗪等从未被观察到的噻虫嗪代谢物。

8、本发明对假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20及其发酵液降解噻虫嗪的能力进行测定，将假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20接种于放线菌液体培养基，28℃、180r/min摇床中振荡培养，配置出菌液浓度为106cfu/ml的种子液。处理组在放线菌液体培养基中接种种子液，接种量为2％，设置3组平行。于28℃、180r/min恒温振荡培养，培养至对数生长期，分别加入底物农药噻虫嗪至其浓度为100mg/l。在相同条件下，以放线菌液体培养基不接入菌种添加噻虫嗪作为空白对照组。定时取样，采用高效液相色谱仪检测培养液中噻虫嗪含量变化。

9、另一方面，本发明请求保护假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20、其发酵液以及含有该菌株的菌剂在降解噻虫嗪中的应用。

10、与现有技术相比，本发明提供的技术方案至少具备下述的有益效果或优点：

11、本发明从宁夏银北岩石地衣中分离纯化出假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20，该菌株具有降解新烟碱类杀虫剂的作用，对于噻虫嗪的降解产物包括脱硝基/胍/亚胺噻虫嗪、脲基噻虫嗪、胍基噻虫胺、n-(2-氯噻唑-5-基)甲基-n-羟甲基甲酰亚胺、噻虫嗪酸，还包括去甲基化胍基噻虫胺和羟基化脲基噻虫嗪等从未被观察到的噻虫嗪代谢物。

12、假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20及其发酵液对噻虫嗪具有降解作用，培养至10d时，降解效果达到最佳，此时噻虫嗪含量为56.98mg/l，即噻虫嗪降解率为43.02％，相比于对照组的噻虫嗪含量为85.96mg/l，噻虫嗪降解率为14.04％，降解率提高了28.98％。

技术特征：

1.假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20，其特征在于，该菌株于于2023年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27343。

2.根据权利要求1所述的假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20，其特征在于，其16srdna序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20，其特征在于，所述假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20发酵培养条件为：放线菌液体培养基、28℃、180r/min摇床振荡培养；

4.权利要求1所述的假诺卡氏菌pseudonocardia sp.qt-f-20在降解新烟碱类杀虫剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述新烟碱类杀虫剂包括噻虫嗪。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述降解新烟碱类杀虫剂后的产物包括：脱硝基/胍/亚胺噻虫嗪、脲基噻虫嗪、胍基噻虫胺、n-(2-氯噻唑-5-基)甲基-n-羟甲基甲酰亚胺和噻虫嗪酸。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述降解新烟碱类杀虫剂后的产物还包括：去甲基化胍基噻虫胺和羟基化脲基噻虫嗪。

技术总结
本发明公开了一株假诺卡氏菌及其应用，假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.QT‑F‑20的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明证明假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.QT‑F‑20及其发酵液对新烟碱类杀虫剂噻虫嗪有降解作用，将菌株与噻虫嗪共同培养后，质谱检测结果表明其降解产物中包含噻虫嗪的降解产物；将上述菌株的发酵液与噻虫嗪共同培养后，培养基中噻虫嗪的含量降低至56.98mg/L，相比于对照组的噻虫嗪含量为85.96mg/L，菌种发酵液对噻虫嗪的降解效果提高了28.98％。本发明为新烟碱类杀虫剂的生物降解提供了性能优良的微生物菌株。

技术研发人员：吴秀丽,刘成,张长汀,马小青,周丽,徐克
受保护的技术使用者：宁夏医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15