一种微孢子虫极管蛋白EcPTP1的重组蛋白及其制备方法和应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种微孢子虫极管蛋白ecptp1的重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1、微孢子虫是一类典型的专性细胞内寄生的单细胞真核生物。微孢子虫在自然界广泛存在，有超过1200种的微孢子虫被划分于微孢子虫门。微孢子虫可以感染脊椎动物和无脊椎动物的所有类群，是一种重要的畜牧业、农业与人类病原体。目前公认能感染人类的微孢子虫中，有两个属的四种微孢子虫占据主要地位。其中脑炎微孢子虫属(encephalitozoon)有兔脑炎微孢子虫(e.cuniculi)、海伦脑炎微孢子虫(e.hellem)和肠脑炎微孢子虫(e.intestinalis)。脑炎微孢子虫感染动物后通常会在动物体内扩散而累计所有器官。免疫力正常的动物感染脑炎微孢子虫后通常无临床症状，但多会伴随多病灶肉芽肿和坏死，并且在其肾、肝、脾和肝中检测到病原体。与免疫力正常的宿主相比，免疫力未成熟的动物在感染脑炎微孢子虫后表现出严重的临床症状，而这些感染通常是致命的，这些动物在感染后会表现出脑膜炎、肾炎、和动脉炎，并能在其脑、肾、脾和肝中检测到病原体。目前，还没有特效治疗微孢子虫病的疫苗和药物，因此，及时诊断脑炎微孢子虫病并控制其传染源是非常重要的。

2、微孢子虫具有独特的侵染机制，可以通过高度特化的极管将微孢子虫孢原质转运到宿主细胞内。极管与孢子前端的锚定盘连接，盘旋在微孢子虫的孢原质周围。当微孢子虫受到适宜的外界环境刺激时，极管会很快弹出，形成50～500μm长的中空管道，将孢原质输送到宿主细胞内。极管为孢原质输送到宿主细胞提供了桥梁，同时也防止孢原质在输送的过程中被外界极端环境所破坏。研究发现，无论是在实验条件下还是在自然感染条件下，极管蛋白都表现出较强的免疫原性。

3、微孢子虫的检测方法主要有病原学检测、分子生物学检测和免疫学检测。微孢子虫的免疫学检测是一种敏感而且特异性强的检测方法，血清学检测通常是活体动物或人类在诊断微孢子虫病时的一种重要方法。目前，对血清特异性抗体的检测主要用从感染动物中收集或经组织、细胞培养的微孢子虫作为抗原，但其纯度较低，成份复杂，容易引起交叉反应，最终影响检测效果。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种微孢子虫极管蛋白ecptp1的重组蛋白及其制备方法和应用，可同时对大量样本进行精准检测，适应基层微孢子虫检测的需要，具有很好的应用前景。

2、本发明提供了一种微孢子虫极管蛋白ecptp1的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明还提供了一种扩增编码上述重组蛋白的基因的引物对，包括核苷酸序列如seq id no.2所示的上游引物和seq id no.3所示的下游引物。

4、本发明还提供了一种表达上述重组蛋白的方法，包括以下步骤：将编码上述重组蛋白的基因连接到表达载体上，构建得到重组表达载体；

5、利用所述重组表达载体转化表达宿主，构建得到重组表达宿主；

6、诱导所述重组表达宿主表达所述重组蛋白。

7、本发明还提供了一种利用原核表达载体制备上述重组蛋白的方法，包括以下步骤：利用上述引物对扩增得到编码上述重组蛋白的基因，将所述基因连接到原核表达载体上，构建得到重组表达载体；

8、利用所述重组表达载体转化原核细胞，得重组工程菌；

9、利用iptg诱导所述重组工程菌进行表达。

10、优选的，所述原核表达载体包括pet-32a(+)。

11、优选的，所述原核细胞包括e.coli rosetta感受态细胞。

12、优选的，在完成所述表达后，还包括纯化。

13、本发明还提供了上述重组蛋白或上所述方法表达得到的重组蛋白或利用上述方法制备得到的重组蛋白在制备检测微孢子虫的试剂中的应用。

14、优选的，当利用免疫学方法检测微孢子虫时，以所述重组蛋白作为抗原。

15、本发明还提供了一种检测微孢子虫的试剂盒，包括抗原和其他免疫学检测试剂；

16、所述抗原为上述重组蛋白或利用上述方法表达得到的重组蛋白或利用上述方法制备得到的重组蛋白。

17、有益效果：本发明提供了一种微孢子虫极管蛋白ecptp1的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。本发明所述重组蛋白，是基于b细胞抗原表位的预测，截取可溶性表达部位的b细胞抗原表位，通过表达系统表达得到。

18、本发明实施例中，利用原核表达系统制备所述重组蛋白，具有蛋白产量高、操作简单、费用低廉等优势。以本发明所述重组蛋白作为诊断抗原时，具有较好的抗原性，可快速、高效的捕获血清中的目标分子，达到快速准确地检出微孢子虫感染的目的，为研制微孢子虫诊断试剂和疫苗打下基础。同时也适用于同属的其他微孢子虫，适用范围广泛。

技术特征：

1.一种微孢子虫极管蛋白ecptp1的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.一种扩增编码权利要求1所述重组蛋白的基因的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no.2所示的上游引物和seq id no.3所示的下游引物。

3.一种表达权利要求1所述重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：将编码权利要求1所述重组蛋白的基因连接到表达载体上，构建得到重组表达载体；

4.一种利用原核表达载体制备权利要求1所述重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求2所述引物对扩增得到编码权利要求1所述重组蛋白的基因，将所述基因连接到原核表达载体上，构建得到重组表达载体；

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述原核表达载体包括pet-32a(+)。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述原核细胞包括e.colirosetta感受态细胞。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，在完成所述表达后，还包括纯化。

8.权利要求1所述重组蛋白或利用权利要求3所述方法表达得到的重组蛋白或利用权利要求4～7任一项所述方法制备得到的重组蛋白在制备检测微孢子虫的试剂中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，当利用免疫学方法检测微孢子虫时，以所述重组蛋白作为抗原。

10.一种检测微孢子虫的试剂盒，其特征在于，包括抗原和其他免疫学检测试剂；

技术总结
本发明公开了一种微孢子虫极管蛋白EcPTP1的重组蛋白及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了一种微孢子虫极管蛋白EcPTP1的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述重组蛋白可通过表达系统表达得到。本发明利用原核表达系统制备所述重组蛋白，以所述重组蛋白作为诊断抗原时，具有较好的抗原性，可快速、高效的捕获血清中的目标分子，达到快速准确地检出微孢子虫感染的目的，为研制微孢子虫诊断试剂和疫苗打下基础。同时也适用于同属的其他微孢子虫，适用范围广泛。

技术研发人员：李田,张蓥
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15