一种靶向B7-H3并共表达细胞因子和趋化因子的CAR-T细胞及其用途

本发明涉及细胞治疗领域，尤其涉及一种靶向b7-h3并共表达细胞因子和趋化因子的car-t细胞。

背景技术：

1、表达嵌合抗原受体(car)的t细胞基因工程(也称为car-t细胞)，是临床治疗上针对血液系统恶性肿瘤的有效方法，被认为是癌症最有效的免疫治疗方法之一。car由与跨膜片段和细胞内共刺激信号结构域融合的细胞外抗原特异性单链片段可变区(scfv)组成，其提供抗原结合位点并同时激活t细胞。car可以特异性识别肿瘤抗原，以非主要组织相容性复合体(mhc)限制的方式触发t细胞活化，并启动细胞外抗肿瘤反应。car-t细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面已显示出显著的疗效。两种靶向cd19的car-t治疗方法已成功用于临床实践，用于治疗血液系统b细胞淋巴瘤。靶向b细胞成熟抗原(bcma)的car-t在临床试验中也显示出积极的治疗效果。然而，在实体瘤的car-t细胞治疗中尚未观察到类似的结果。实体瘤具有更复杂的免疫抑制微环境，肿瘤内有许多免疫抑制细胞和细胞因子抑制t细胞的活性。此外，致密细胞外基质(ecm)还可以阻止car-t细胞浸润到实体瘤中，并影响car-t细胞的活性。

2、在培养过程中，额外的细胞因子如il-7和il-15可以促进car-t细胞的有效增殖，并维持其car-t细胞记忆表型。然而，仅在在培养过程中添加额外的il-7和il-15并没有更好的体内杀伤效果。t细胞，包括car-t细胞，很难穿透细胞外基质渗透到肿瘤中。有报道称，il-7的共同表达增强了car-t细胞的体内持久性，并通过增强其扩张、抑制凋亡和衰竭来改善基于nkg2d的car-t对前列腺癌症的治疗。研究人员还发现，在car设计中共同表达il-7和ccl-19对实体瘤有更大的临床效果，促进淋巴细胞向肿瘤细胞浸润。il-15诱导t细胞的活化、增殖和存活，并具有增加记忆t细胞亚群的功能。il-7和il-15的共同表达可以指导幼稚前体产生人类记忆干t细胞，并提供理想的长期持久性car-t细胞。过去已经研究了il-7和ccl-19在car-t细胞中的共表达，但文献中尚未报道il-7、il-15和ccl--19在cart细胞中的共同表达。

3、b7-h3是属于b7家族的蛋白质。b7-h3在大多数肿瘤细胞表面表达，但很少在正常细胞中表达。b7-h3在肿瘤中的表达与预后不良有关。抗b7-h3抗体药物的几项临床试验报道了对实体瘤的良好效果，并证明了对人类患者的安全性。因此，b7-h3是使用car-t细胞治疗实体瘤的有吸引力的靶标。il-7，il-15和ccl-19的共表达也可能在实体瘤的car-t细胞治疗中发挥积极作用。当car-t细胞用于治疗实体瘤时，需要增强其在肿瘤微环境中的浸润、增殖和存活。

4、非小细胞肺癌(nsclc)和胰腺癌都是高度侵袭性和快速增长的恶性肿瘤，死亡率高，缺乏有效治疗。car-t细胞治疗非小细胞肺癌和胰腺肿瘤的临床试验很多。然而，迄今为止的治疗效果并不令人满意。免疫抑制微环境和ecm对于car-t细胞治疗实体瘤来说尤其麻烦。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种靶向b7-h3并共表达il-7/il-15和ccl-19的car-t(h3-7/15×19car-t)。

2、为实现上述目的，本发明提供一种靶向b7-h3并共表达细胞因子和趋化因子的car-t细胞，其特征在于，含有b7-h3单链抗体，il-7和ccl-19；优选的，其中il-7和ccl-19均通过2a肽序列1连接；

3、所述b7-h3单链抗体的氨基酸序列如seq id no:1所示，il-7的氨基酸序列如seqid no:6所示；ccl-19的氨基酸序列如seq id no:8所示；所述2a肽序列1的氨基酸序列如seq id no:9所示。

4、进一步，是将含有b7-h3单链抗体序列的car序列，il-7和ccl-19序列克隆入plvx-cd19car得到。

5、进一步，制备方法为，将car、il-7和ccl-19基因，其中il-7,ccl-19基因由2a肽序列1连接，将其克隆到慢病毒载体中，即得到靶向b7-h3并共表达il-7和ccl-19的car-t细胞；

6、所述car为b7-h3单链抗体连接cd8 hinge，cd8 tm，4-1bb和cd3z序列；

7、所述cd8 hinge的氨基酸序列如seq id no:2所示；所述cd8 tm的氨基酸序列如seq id no:3所示；所述4-1bb的氨基酸序列如seq id no:4所示；所述cd3z的氨基酸序列如seq id no:5所示。

8、进一步，还含有il-15，其中il-7,il-15和ccl-19均通过2a肽序列2连接；

9、所述il-15的氨基酸序列如seq id no:7所示；2a肽序列2的氨基酸序列如seqidno:10所示。

10、进一步，是将含有b7-h3单链抗体序列的car序列，il-7，il-15和ccl-19克隆入plvx-cd19 car得到。

11、进一步，将car、il-7，il-15和ccl-19基因，其中il-7,il-15,ccl-19基因由两个2a肽序列连接，将其克隆到慢病毒载体中，即得到靶向b7-h3并共表达il-7/il-15,ccl-19的car-t细胞；

12、所述car为，b7-h3单链抗体连接cd8 hinge，cd8 tm，4-1bb和cd3z序列。

13、本发明还保护所述靶向b7-h3并共表达的car-t细胞用于制备治疗癌症药物的用途。

14、进一步，所述癌症不限于胃癌、卵巢癌症、胰腺癌、结肠癌，黑色素瘤，肺癌，舌鳞癌和卵巢癌。

15、本发明使用靶向b7-h3并共表达il-7/il-15和ccl-19的car-t(h3-7/15×19car-t)作为nsclc和胰腺肿瘤的假定治疗方法。与阴性cd19 car-t对照和h3-7×19car-t相比，h3-7/15×19car-t在ncg小鼠模型中显示出显著改善了肿瘤组织的浸润和扩张，并有效减少了肿瘤。这项研究应该为用靶向b7-h3阳性肿瘤细胞的car-t细胞治疗nsclc和胰腺肿瘤的新策略提供基础。

技术特征：

1.一种靶向b7-h3并共表达细胞因子和趋化因子的car-t细胞，其特征在于，含有b7-h3单链抗体，il-7和ccl-19；优选的，其中il-7和ccl-19均通过2a肽序列1连接；

2.如权利要求1所述靶向b7-h3并共表达细胞因子和趋化因子的car-t细胞，其特征在于，是将含有b7-h3单链抗体序列的car序列，il-7和ccl-19序列克隆入plvx-cd19 car得到。

3.如权利要求1所述靶向b7-h3并共表达细胞因子和趋化因子的car-t细胞，其特征在于，制备方法为，将car、il-7和ccl-19基因，其中il-7,ccl-19基因由2a肽序列1连接，将其克隆到慢病毒载体中，即得到靶向b7-h3并共表达il-7和ccl-19的car-t细胞；

4.如权利要求1所述靶向b7-h3并共表达细胞因子和趋化因子的car-t细胞，其特征在于，还含有il-15，其中il-7,il-15和ccl-19均通过2a肽序列2连接；

5.如权利要求4所述靶向b7-h3并共表达细胞因子和趋化因子的car-t细胞，其特征在于，是将含有b7-h3单链抗体序列的car序列，il-7，il-15和ccl-19克隆入plvx-cd19car得到。

6.如权利要求4所述靶向b7-h3并共表达细胞因子和趋化因子的car-t细胞，其特征在于，将car、il-7，il-15和ccl-19基因，其中il-7,il-15,ccl-19基因由两个2a肽序列连接，将其克隆到慢病毒载体中，即得到靶向b7-h3并共表达il-7/il-15,ccl-19的car-t细胞；

7.权利要求1-6任一所述靶向b7-h3并共表达的car-t细胞用于制备治疗癌症药物的用途。

8.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述癌症不限于胃癌、卵巢癌症、胰腺癌、结肠癌，黑色素瘤，肺癌，舌鳞癌和卵巢癌。

技术总结
本发明公开了一种靶向B7‑H3并共表达细胞因子和趋化因子的CAR‑T细胞及其用途。含有B7‑H3单链抗体，IL‑7和CCL‑19；或者B7‑H3单链抗体，IL‑7,IL‑15和CCL‑19。使用本发明的靶向B7‑H3并共表达的CAR‑T细胞在NCG小鼠模型中显示出显著改善了肿瘤组织的浸润和扩张，并有效减少了肿瘤的效果。

技术研发人员：张琼,林基祯,方树彬,许云禄
受保护的技术使用者：福建医科大学附属协和医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16