用于检测组织切片中戊型肝炎病毒的探针及其应用

本发明属于生物检测，是一种用于检测临床hev患者组织切片中戊型肝炎病毒的探针，可应用于临床样本及多种组织中戊型肝炎病毒的检测。

背景技术：

1、在1980年代，戊型肝炎病毒首次被认为是导致不明原因急性肝炎流行的原因。至今，戊型肝炎病毒已成为全球范围内急性病毒性肝炎常见的原因之一。

2、戊型肝炎病毒(hev)是一种准包膜的单股正链rna病毒。hev主要分为8种基因型，其中基因1-4型为人类感染毒株。研究表明hev基因1型和2型仅感染人类，而基因3型和基因4型可以人畜共患。一般通过食用未煮熟的猪肉和野猪肉感染。并且猪源的hev可以在balb/c小鼠体内复制。大多数hev感染的患者是无症状、自限性的。在一般人群中的死亡率约为0.2％-1％。然而，在妊娠期间，hev感染可呈暴发性病程，导致暴发性肝衰竭、早产、自然流产和死胎。来自不同发展中国家的研究表明，妊娠期间hev感染的发生率很高，很大一部分孕妇进展为暴发性肝炎，死亡率高达30％。戊型肝炎病毒肝炎可引起肝脏症状以及多种肝外表现，多种研究证明，胰腺炎、神经系统症状、血液系统疾病以及肾小球肾炎都与hev感染有关。此外，hev可以在胎盘、胎膜和脐带中复制，导致胎盘发生严重的组织病理性损伤和炎症反应，并将病毒从母体垂直传播给胎儿。

3、目前，戊型肝炎病毒(hev)的感染通常是通过血清学进行流行病学的诊断。尽管检测hev抗体有助于了解hev血清阳性率以及现时和既往感染，但一些研究表明，在筛查供体血液制品hev持续性感染方面缺乏敏感性。igm在hev感染早期阶段无法进行检测，只有在感染后2-4周才能短暂检测出，然而这时血液和粪便中的病毒载量已经开始下降。利用动物模型还发现，在hev持续性感染的恒河猴中并未检测到igm，因此往往造成感染者的漏诊。虽然在感染后1-6个月在血清中可以检测到hev igg抗体，但此时患者已经排毒结束，没有临床诊断价值。因此，仅依靠抗体检测会导致hev急性感染的患者漏诊，从而错过最佳的治疗时间，并造成环境及密接人群感染。

4、hev rna检测是用来确认血液和器官移植患者中hev感染的主要方法。hev rna检测是目前确认hev感染的金标准。hev rna检测主要包括:常规pcr、实时荧光定量pcr、多重pcr和巢式pcr。然而，在进行hev rna检测实验时，我们需要对其gdna进行提取，提取过程不仅繁琐，而且gdna在提取过程中会发生不同程度的降解和损失。常规pcr在操作过程中容易污染，只能进行定性分析，而且敏感性较低，在扩增时会存在非特异性扩增，当非特异性扩增的条带和目的条带大小一样时无法进行区分。实时荧光定量pcr尽管在灵敏性上有了大幅度提高，并且可以进行定量分析，但是依然存在各种问题，比如：目的基因发生突变导致漏检、低浓度模板检测结果无法确定、使用标准曲线进行定量检测时误差较大。多重pcr相对于常规pcr具有灵敏性高、特异性强的优点，但是避免不了其易受污染、扩增引物的选择复杂以及实验条件的难以控制等缺点。由于巢式pcr经历过两轮扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的灵敏性，又有两对pcr引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。但是正是由于巢式pcr检测过程的特点，从而增加了每次实验的复杂性，也使得每次实验的时间成本在不断增加。

5、尽管这些hev检测方式在随着科技的进步在不断的改善，但是没有应用范围广、操作简便、灵敏度高、特异性强的检测试剂。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测hev患者组织切片中戊型肝炎病毒的探针hev-orf2-dig，本发明利用可在组织或细胞中原位检测单一分子rna的原位杂交技术rnascope，可实现对hev患者组织切片中hev rna的快速检测；该方法具有特异性强、灵敏度高、适应范围广、操作简便、检测时间短、检测结果准确可靠以及实验结果可视化等优点，有效解决现有检测技术中灵敏度低、漏诊或误诊、单一引物组检测范围窄、假阳性率高的问题，本发明适用于临床以及多种组织样品的针对hev的快速检测，将其作为金标准，并以血清学抗体检测、rt-qpcr法、血清hev rna检测为辅助手段，对hev感染实现快速准确确诊，有利于临床使用和推广。

2、本发明用于检测hev患者组织切片戊型肝炎病毒探针hev-orf2-dig的核酸序列如下：

3、ggcgtattagtgtaggaattcacaggcgacccatgaatgcagagcataacaaggccggaggtagcctcttcctcagcgacgcc。

4、本发明目的通过以下方法实现：

5、1、探针设计

6、从ncbi上下载不同基因型的hev rna全长序列，通过比对选取hev orf2上一段83bp的保守序列，并在5’端加上地高辛标记，由擎科生物公司合成探针hev-orf2-dig；

7、2、样本取材

8、将感染hev和未感染hev的balb/c小鼠采用颈椎脱臼处死法处死，将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠的整个胸部和腹部，修剪去除腹部毛发，75％酒精擦拭腹部进行消毒；剪开腹膜，暴露腹腔，取出小鼠肝脏和胎盘，置于无菌培养皿中，生理盐水冲洗；

9、3、组织脱水包埋切片

10、用4％多聚甲醛固定取出的肝脏和胎盘样品，在室温下固定16-32小时，常规脱水机脱水处理，然后利用石蜡包埋机和切片机制成石蜡切片；

11、(所述待测样品为空白对照组(mock，未感染hev)和hev感染不同天数的spf级balb/c小鼠的肝组织和胎盘组织)；

12、4、rnascope原位杂交检测

13、使用hev-orf2-dig探针，采用rnascope原位杂交方法检测空白对照组(mock,未感染hev)和hev感染不同天数的spf级balb/c小鼠肝脏和胎盘组织切片中的hev；

14、结果显示hev-orf2-dig探针能特异性检测到感染不同天数的balb/c小鼠肝脏组织和胎盘组织中hev rna的存在。

15、本发明优点和技术效果如下：(1)灵敏度高；(2)特异性识别hev rna；(3)适用于多种组织的石蜡切片；(4)操作简便，检测时间短；(5)检测结果准确可靠。

16、本发明探针hev-orf2-dig通过利用rnascope原位杂交的方法，实现了对hev rna的快速检测，使用本发明探针hev-orf2-dig可对感染不同天数的组织样本中戊型肝炎病毒进行高效、准确的检测，且具有灵敏度高、特异性强、适应范围广、操作简便、检测结果准确可靠、检测时间短等优点，解决了灵敏度低、漏诊或误诊的问题，适合临床肝脏组织及多种样品的hev快速检测，其对于临床戊肝早期筛查，指导临床用药，以及为传染源调查工作奠定基础。

技术特征：

1.一种用于检测组织切片中戊型肝炎病毒的探针，所述探针的核苷酸序列如seq idno:1所示。

2.权利要求1所述的用于检测组织切片中戊型肝炎病毒的探针在制备检测组织切片中戊型肝炎病毒试剂盒中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于检测组织切片中戊型肝炎病毒的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明探针利用RNAscope原位杂交的方法，实现了对HEV RNA的快速检测，使用本发明探针HEV‑ORF2‑DIG可对组织样本中戊型肝炎病毒进行高效、准确的检测，且具有灵敏度高、特异性强、适应范围广、操作简便、检测结果准确可靠、检测时间短等优点，适合临床肝脏组织及多种样品的HEV快速检测。

技术研发人员：黄芬,刘慧婵,陈冬雪,沈宇杰
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16