嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用的制作方法

本发明涉及嵌合抗原受体，特别地涉及嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用。

背景技术：

1、嵌合抗原受体(car)是由识别肿瘤特异性抗原的抗体的抗原结合部与跨膜结构域和胞内结构域构成的嵌合受体。car主要由三个功能域构成，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域由负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scfv)及一段起连接作用的铰链区(hinge)构成。胞内结构域由共刺激结构域和信号转导结构域构成。

2、通过基因转导的方法将car基因序列转染免疫细胞，如t细胞，nk细胞，使其表达car，从而增强患者免疫细胞的功能，能够生成大量肿瘤抗原特异性的car细胞。这种car免疫细胞输注到患者体内，嵌合抗原受体可以特异性地追踪和识别并引导免疫细胞杀伤肿瘤细胞。car-免疫细胞疗法，作为近年来一种较为新型的细胞治疗方案，在癌症治疗领域取得了许多突破性进展，尤其是嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t cell，car-t)免疫疗法在b细胞等血液系统肿瘤中治疗效果显著，能够特异、高效及持续的攻击肿瘤细胞，但该疗法受到肿瘤微环境和t细胞耗竭等因素影响，car-t疗法在实体瘤领域的应用仍在探索之中，在实体瘤中的应用和发展是其瓶颈。

3、脑胶质瘤是起源于脑神经胶质细胞的实体肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌。脑胶质瘤发病机制尚不明了，治疗手段仍依赖于手术，放疗和化疗。小胶质细胞是定植在中枢神经系统中的免疫细胞，是神经胶质瘤相关的巨噬细胞，在神经系统发育和疾病发展过程中发挥重要功能。如果能通过改造加强小胶质细胞的功能，使小胶质细胞特异性杀伤肿瘤细胞，改善肿瘤微环境，降低细胞因子风暴的副作用，将为胶质瘤患者造福。

4、双唾液酸神经节苷脂gd2是一种主要表达在胶质瘤(脑瘤，视网膜母细胞瘤等中枢神经母细胞瘤、黑色素瘤等肿瘤)上的抗原，在正常组织中表达量低且局限，是神经胶质瘤免疫治疗理想的肿瘤抗原，目前已有针对gd2的特异性抗体用于神经母细胞瘤的免疫治疗，但是由于抗体治疗主要存在于外周血中难以精准进入肿瘤组织或肿瘤微小残留部位，且抗体易降解无法长期存在体内，增加了治疗的困难性。此前cn 106536563a和cn 108948211a公开了gd2结合的嵌合抗原受体均在t细胞上通过转基因技术构建针对gd2的car t，虽然在癌症治疗中有一定作用，但是正常中枢神经系统和视网膜中t细胞含量少，即使疾病状态下t细胞从外周血中转移到中枢神经系统和视网膜的t细胞也很难进入实体瘤，难以发挥治疗作用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用。

2、本发明所提供的嵌合抗原受体，为基于双唾液酸神经节苷脂的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域；其中：

3、所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原双唾液酸神经节苷脂的单链抗体；

4、所述跨膜结构域为cd8α跨膜结构域；

5、所述共刺激信号传导结构域为cd86信号传导结构域和fcγr1信号传导结构域的组合。

6、可选地，所述针对肿瘤表面抗原双唾液酸神经节苷脂的单链抗体的氨基酸序列如seq id no.3所示；

7、所述cd8α跨膜结构域的氨基酸序列如seq id no.5所示；

8、所述共刺激信号传导结构域为cd86信号传导结构域和fcγr1信号传导结构域的顺序组合，所述共刺激信号传导结构域的的氨基酸序列如seq id no.6所示。

9、可选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽；所述信号肽的氨基酸序列如seq idno.2所示。

10、可选地，所述嵌合抗原受体还包括铰链区，所述铰链区的氨基酸序列如seq idno.4所示。

11、可选地，所述嵌合抗原受体由信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、2a序列和绿色荧光蛋白序列串联而成，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqid no.1所示。

12、本发明还提供一种含有嵌合抗原受体的慢病毒。

13、本发明所提供的的含有嵌合抗原受体的慢病毒，包括所述的嵌合抗原受体。

14、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法也属于本发明的保护范围。

15、本发明所提供的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法，包括如下步骤：将小胶质细胞培养后，感染所述含有嵌合抗原受体的慢病毒，通过绿色荧光观察转染效率再通过嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，最后挑选阳性克隆细胞进行培养鉴定，即得到表达嵌合抗原受体的小胶质细胞。

16、可选地，所述进行阳性克隆筛选是通过绿色荧光观察转染效率再通过嘌呤霉素进行阳性克隆筛选。

17、可选地，所述小胶质细胞为小胶质细胞系hmc3；所述表达嵌合抗原受体的小胶质细胞为car-gd2小胶质细胞。

18、所述的方法制备得到的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞也属于本发明的保护范围。

19、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞在制备治疗表达双唾液酸神经节苷脂抗原的肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

20、本发明所提供的表达针对基于双唾液酸神经节苷脂的嵌合抗原受体(即针对gd2抗原的嵌合抗原受体)小胶质细胞(即car-gd2小胶质细胞)，其可精准地识别肿瘤细胞，并长期存活，可用于治疗表达gd2抗原的肿瘤，缓解病人痛苦。

21、与car-t和car-nk相比，car-小胶质细胞作为一种全新的细胞免疫疗法相比于car-t和car-nk疗法，其具有浸润肿瘤能力强、促进抗原提呈能力和增强杀伤功能、非肿瘤靶向毒性较小等独特的优势。希望随着研究的深入，car-小胶质细胞在患者身上显示出疗效、并在临床中得到应用，为胶质瘤患者造福。

技术特征：

1.一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体为基于双唾液酸神经节苷脂的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域；其中：

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体还包括信号肽；所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体还包括铰链区，所述铰链区的氨基酸序列如seq id no.4所示。

5.根据权利要求1至4中任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体由信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、2a序列和绿色荧光蛋白序列串联而成，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.1所示。

6.一种含有嵌合抗原受体的慢病毒，其特征在于：包括权利要求1至5中任一项所述的嵌合抗原受体。

7.表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法，所述表达嵌合抗原受体的小胶质细胞为表达权利要求1至5中任一所述的嵌合抗原受体的小胶质细胞，其特征在于：包括如下步骤：将小胶质细胞培养后，感染权利要求6所述的慢病毒，进行阳性克隆筛选，挑选阳性克隆细胞进行培养鉴定，即得到表达嵌合抗原受体的小胶质细胞。

8.根据权利要求7所述的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法，其特征在于：所述小胶质细胞为小胶质细胞系hmc3；所述表达嵌合抗原受体的小胶质细胞为car-gd2小胶质细胞。

9.权利要求7或8所述的方法制备得到的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞。

10.表达嵌合抗原受体的小胶质细胞在制备治疗表达双唾液酸神经节苷脂抗原的肿瘤的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及应用。本发明所提供的嵌合抗原受体，包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域；其中：所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原双唾液酸神经节苷脂的单链抗体；所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域；所述共刺激信号传导结构域为CD86信号传导结构域和FcγR1信号传导结构域的组合。本发明所提供的表达针对GD2抗原的嵌合抗原受体小胶质细胞(CAR‑GD2小胶质细胞)，其可精准地杀伤肿瘤细胞，并长期存活，希望可用于治疗表达GD2抗原的肿瘤，缓解病人痛苦。

技术研发人员：金子兵,许佳
受保护的技术使用者：北京市眼科研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16