生物样本处理液、生物样本真菌检测试剂盒及它们的应用的制作方法

本发明涉及真菌检测技术，具体地，涉及一种生物样本处理液、生物样本真菌检测试剂盒及它们的应用。

背景技术：

1、真菌容易引起真菌感染，包括浅表真菌病和深部真菌病。浅表真菌病是指由病原真菌所引起的人类皮肤以及粘膜、毛发和指甲等附属器官的一大类感染性疾病，如头癣、手足癣、甲癣等。深部真菌病是指致病性真菌侵犯深部组织、内脏、血液等器官和系统，也成侵袭性真菌病，严重危及患者健康的疾病。

2、取决于致病真菌的种类，有多种检验方法可用于侵袭性真菌病的诊断，包括血培养法、涂片染色法(包括革兰氏染色、koh压片、六胺银染色、过碘酸雪夫染色、墨汁染色、真菌荧光染色)、免疫检测法(g试验、gm试验、隐球菌荚膜抗原检测、曲霉igg检测)和分子检测。其中，血培养法是侵袭性真菌病检测的金标准，灵敏度可达1cfu/ml，但需要至少2-3天的时间，对于部分真菌甚至需要2-3周的时间。免疫检测法仅在真菌感染较为严重，向体液中释放了较多真菌物质或引发免疫反应后才能够检测。分子检测操作较为复杂，仅能对真菌进行针对性的检测(需要匹配对应的检测引物)，且对于真菌浓度低的样本容易造成假阳性或假阴性的结果。涂片染色法是快速、直观检测样本真菌的方法，且不受真菌种类的限制，尤其真菌荧光染色法是一种高效快速、特异性高、敏感型腔且较传统染色法更为精准的一种方法。真菌荧光染色液主要由荧光增白剂28、伊文思蓝、氢氧化钾和细胞穿透成分(二甲基亚砜、甘油等)组成；氢氧化钾和细胞穿透成分可以软化、穿透样本，使荧光染料能够接触到样本内部的真菌；荧光增白剂28能够与各种真菌细胞壁上的多糖、几丁质结合，在紫外光(340-380nm)激发下发出亮蓝色荧光，从而显示出清晰的真菌结构；伊文思蓝能够抑制背景荧光和非特异性的荧光染色，增强真菌染色的对比度。

3、目前真菌荧光染色主要应用于浅表性真菌感染，因其样本容易获得(指甲屑、表皮、阴道分泌物)且真菌数量较多，容易在镜下识别。而侵袭性真菌病的样本通常含有的真菌浓度较低，甚至低于10cfu/ml，此种情况下使用常规镜检法无法有效进行检测，且镜检法使用的样本量通常不超过100μl，每份镜检样本中的真菌会低于1cfu，难以在显微镜下找到并与杂质相区分。此外，对于血液或痰液、肺泡灌洗液等样本检测，样本中的细胞、组织碎片等杂志会对真菌检测带来严重的干扰，使镜检法无法检测真菌含量较低的体液样本。

4、针对侵袭性真菌病的样本的荧光染色检测，虽然已开发出多种样本富集及制片方法，但是仍存在对样本中真菌的富集作用有限、适用的样本种类较少、处理及检测过程繁琐等缺陷，以致于难以实现低浓度侵袭性真菌样本的检测。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的难以实现低浓度侵袭性真菌样本检测的问题，提供一种生物样本处理液、生物样本真菌检测试剂盒及它们的应用，该处理液对真菌的检测灵敏度高，操作简便，能适用于多种体液样本。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种生物样本处理液，该生物样本处理液含有还原剂、蛋白溶解剂、细胞裂解剂、密度调节剂和水，其中，所述细胞裂解剂含有十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚。

3、优选地，所述细胞裂解剂中十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的重量比为0.2-15:0.2-2:1，更优选为0.5-10:0.5-1:1。

4、优选地，该生物样本处理液中所述还原剂的含量为5-25mm，优选为8-20mm；所述蛋白溶解剂的含量为1-8重量％，优选为2-5重量％；所述细胞裂解剂的含量为0.3-3重量％，优选为1-3重量％；所述密度调节剂的含量为20-50重量％，优选为30-40重量％。

5、优选地，所述还原剂选自β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、n-乙酰半胱氨酸和三(2-羧乙基)膦中的至少一种。

6、优选地，所述蛋白溶解剂为氢氧化钠和/或氢氧化钾。

7、优选地，所述密度调节剂选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种。

8、本发明第二方面提供一种生物样本真菌检测试剂盒，该试剂盒含有上述的生物样本处理液。

9、优选地，该试剂盒还含有吸附载玻片和真菌荧光染色液。

10、优选地，所述吸附载玻片为阳离子吸附载玻片，所述真菌荧光染色液为化学染色液和/或免疫染色液。

11、本发明第三方面提供上述的生物样本处理液和/或上述的生物样本真菌检测试剂盒在制备真菌检测产品中的应用。

12、本发明第四方面提供一种生物样本中真菌检测的方法，该方法包括以下步骤：

13、s1、将待测生物样本与上述的生物样本处理液混合进行孵育得到待测液；

14、s2、将所述待测液经液基薄层制片后进行荧光染色、荧光镜检。

15、优选地，步骤s1中，所述待测生物样本与所述生物样本处理液的体积比为1:0.5-3。

16、优选地，所述孵育的条件至少包括：温度为5-40℃，时间为20-40min。

17、优选地，步骤s2中，所述液基薄层制片的过程包括：将所述待测液经沉降至载玻片上得到玻片样本，其中，所述沉降的方式采用离心沉降、自然沉降或者膜过滤。

18、优选地，所述载玻片采用阳离子吸附载玻片，所述离心沉降采用离心制片机进行，所述膜过滤采用孔径为4-6μm的滤膜。

19、优选地，所述离心沉降或者所述自然沉降的时间为20-60min。

20、优选地，所述荧光染色采用化学染色液和/或免疫染色液，所述荧光镜检采用荧光显微镜和荧光摄像软件进行。

21、通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

22、本发明提供的生物样本处理液将十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚相配伍作为细胞裂解剂，能够高效裂解样本中含有的细胞、组织碎片，释放出存在于细胞内部的真菌，并去除干扰检测制片的非真菌有形物质；该细胞裂解剂与还原剂、蛋白溶解剂、密度调节剂形成的处理液，不仅实现生物样本仅需一步处理即可制片用于真菌荧光检测，操作简便，而且对真菌的富集效果佳，能够检测低浓度的真菌样本，最低检测限可达10cfu/ml；该处理液可处理血液、痰液、支气管灌洗物、胸腹水、脓液和创伤感染组织、脑脊液、关节液、阴道分泌物或尿液等多种体液样本，适用的样本类型广泛。

技术特征：

1.一种生物样本处理液，其特征在于，该生物样本处理液含有还原剂、蛋白溶解剂、细胞裂解剂、密度调节剂和水，其中，所述细胞裂解剂含有十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚。

2.根据权利要求1所述的生物样本处理液，其特征在于，所述细胞裂解剂中十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的重量比为0.2-15:0.2-2:1，优选为0.5-10:0.5-1:1。

3.根据权利要求1或2所述的生物样本处理液，其特征在于，该生物样本处理液中所述还原剂的含量为5-25mm，优选为8-20mm；所述蛋白溶解剂的含量为1-8重量％，优选为2-5重量％；所述细胞裂解剂的含量为0.3-3重量％，优选为1-3重量％；所述密度调节剂的含量为20-50重量％，优选为30-40重量％。

4.根据权利要求1或2所述的生物样本处理液，其特征在于，所述还原剂选自β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、n-乙酰半胱氨酸和三(2-羧乙基)膦中的至少一种；

5.一种生物样本真菌检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1至4中任意一项所述的生物样本处理液。

6.根据权利要求5所述的生物样本真菌检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有吸附载玻片和真菌荧光染色液；

7.权利要求1至4中任意一项所述的生物样本处理液和/或权利要求5或6所述的生物样本真菌检测试剂盒在制备真菌检测产品中的应用。

8.一种生物样本中真菌检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述待测生物样本与所述生物样本处理液的体积比为1:0.5-3；

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤s2中，所述液基薄层制片的过程包括：将所述待测液经沉降至载玻片上得到玻片样本，其中，所述沉降的方式采用离心沉降、自然沉降或者膜过滤；

技术总结
本发明涉及真菌检测技术，公开了一种生物样本处理液、生物样本真菌检测试剂盒及它们的应用。该生物样本处理液含有还原剂、蛋白溶解剂、细胞裂解剂、密度调节剂和水，其中，所述细胞裂解剂含有十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚。生物样本真菌检测试剂盒含有上述的生物样本处理液。生物样本中真菌检测的方法包括以下步骤：将待测生物样本与上述的生物样本处理液混合进行孵育得到待测液；将所述待测液经液基薄层制片后进行荧光染色、荧光镜检。该处理液对真菌的检测灵敏度高，操作简便，能适用于多种体液样本。

技术研发人员：牛英波
受保护的技术使用者：深圳玖明医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16