一种生物合成法制备王浆酸及其在护肤中的应用的制作方法

本发明属于基因工程和生物合成，具体涉及一种生物合成法制备王浆酸及其在护肤中的应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、王浆酸即10-羟基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid，10-hda），是蜂王浆中的一种不饱和脂肪酸。其来源单一，目前在自然界只存在于蜂王浆中，在蜂王浆中含量仅为1.4%-2.4%。在对王浆酸的功效研究中发现，王浆酸与蜂王浆同样有较强的保健功能和医疗效果，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、调节血糖等作用。

3、目前国内王浆酸合成主要以物理提取法、化学合成法为主，提取成本高昂，无法满足大量需求。现阶段，一般采用物理萃取法从蜂王浆中进行提取，由于蜂王浆数量少，该提取方法不适宜于大规模生产，用到大量有机溶剂，成本较高；而在化学法制备方面，通常有α-烯与四氯化碳加成水解法、羧酸α-脱卤法和knoevenagel缩合法等，但大部分化学合成法反应条件苛刻，除缩合法外收率较低，形成的双键为顺反混合物，难以提取。目前，生物合成法制备王浆酸还处于研究阶段，且产量不稳定，急需获得功能稳定的工程菌株以期批量制备王浆酸。

4、皮肤屏障使“内部”和“外部”形成一层保护层，防止外部伤害，其中神经酰胺、脂肪酸、甘油三酯和胆固醇等表皮脂质是表皮屏障形成和维持功能的必要成分。脂肪酸约占角质层脂质总重量的15-20%，在人表皮角质层的结构稳定、表皮屏障损伤修复中起重要作用，脂肪酸的减少会导致皮肤屏障功能的受损，并导致各类皮肤炎症发生。研究表明，衰老皮肤中脂质含量明显下降，这也是导致老化皮肤屏障功能降低的重要原因。在皮肤中，ros可以与角质层中的保护性脂质双层反应形成脂质氢过氧化物，这可能导致皮肤屏障功能的减弱。因此，保持角质层细胞脂质、神经酰胺含量，并减少脂质过氧化，是修复受损皮肤屏障的有效手段。在外界环境刺激下，早期细胞老化而引起细胞寿命的降低，主要机制是由于细胞核和dna损伤引起的，细胞核形状异常，破坏了细胞核的功能，包括改变组蛋白修饰模式、异常染色质再生、受损的细胞核转移、dna修复反应的延迟和缩短细胞核端粒的长度。因此，修复受损dna，延长细胞核端粒的长度是抵抗细胞老化的关键。此外，在细胞正常生命活动中，线粒体是所有生命活动的动力源，不仅提供细胞90%以上的能量，而且深度调控能量代谢、ros与自由基、氧化应激、炎症等活动；线粒体利用氧分子的同时也不断受到自由基的伤害，导致线粒体功能障碍，引起皮肤老化。因此，针对外部刺激引起的皮肤老化，可以从增强皮肤脂质屏障、减少线粒体损伤以及修复细胞dna并减缓细胞核端粒缩短等途径抵抗皮肤衰老。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种生物合成法制备王浆酸及其在护肤中的应用。本发明基于酵母工程菌利用含有反式-2-癸烯酸的培养基发酵产生王浆酸；通过皮肤细胞水平、皮肤模型水平上评价，所述王浆酸能够促进衰老皮肤角质层脂质、神经酰胺的合成，修护皮肤屏障；同时能够促进皮肤成纤维细胞中线粒体atp、nadph的合成，降低线粒体活性氧含量，改善线粒体功能异常，抑制细胞凋亡；进一步实验发现，王浆酸能够修复成纤维细胞在紫外照射下的dna损伤，并减缓细胞分裂复制导致的端粒缩短，强化对染色体末端的保护。基于上述研究成果，从而完成本发明。

2、为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：

3、本发明的第一个方面，提供一种基于生物合成法制备王浆酸的方法，所述方法包括：

4、将至少含有cyp153a33-cprbm3融合基因的酵母工程菌，利用含有反式-2-癸烯酸的培养基发酵生产王浆酸。

5、其中，所述cyp153a33-cprbm3融合基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。该融合基因通过密码子优化，从而使其更易在酿酒酵母中进行表达，通过试验证明，表达上述cyp153a33-cprbm3融合基因的酵母工程菌能够与底物反式-2-癸烯酸进行反应获得所述王浆酸，其产量可达到190 mg/l。

6、进一步的，所述酵母工程菌还可以含有辅助基因sil1p和/或辅助基因crp5p。

7、其中，所述辅助基因sil1p的核苷酸序列如seq id no.2所示，辅助基因crp5p的核苷酸序列如seq id no.3所示。通过导入辅助基因sil1p和crp5p，能够进一步提高酵母工程菌生产王浆酸的能力。

8、所述方法还可以包括对王浆酸进行分离、纯化及干燥中的任意一个或多个步骤。因此，所述王浆酸可以是液体制剂或者固体（如颗粒）制剂。

9、本发明的第二个方面，提供上述方法和/或上述方法制得的王浆酸在如下任意一种或多种中的应用：

10、（a）增加表皮层中神经酰胺和脂肪酸的含量，修复皮肤屏障或制备增加表皮层中神经酰胺和脂肪酸的含量，修复皮肤屏障的产品；

11、（b）修复真皮层成纤维细胞dna损伤或制备修复真皮层成纤维细胞dna损伤的产品；

12、（c）改善线粒体功能，提高细胞功能，促进新陈代谢或制备改善线粒体功能，提高细胞功能，促进新陈代谢的产品；

13、（d）延缓细胞分裂复制导致的端粒缩短，保护染色体末端结构完整或制备延缓细胞分裂复制导致的端粒缩短，保护染色体末端结构完整的产品。

14、上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

15、1）与物理提取和化学法制备王浆酸相比，上述技术方案提供了一种利用生物合成制备王浆酸的方法，该方法天然、绿色、且安全；同时，上述技术方案首次将cyp153a33-cprbm3融合基因在酿酒酵母中进行密码子优化表达，重组表达cyp153a33-cprbm3与底物反式-2-癸烯酸反应后可以获得10-hda，产量可以达到190mg/l，优于cn202211449654.3中所报道的重组蛋白cyp539a7*-f0cpr*作用癸烯酸获得10-hda产量。此外；上述技术方案构建cyp153a33-cprbm3融合基因分别与酿酒酵母中辅助蛋白基因sil1p和crp5p共转化表达，能够有效提高酵母工程菌中10-hda的产量。辅助蛋白基因sil1p连接蛋白10-hda产量可以达到280mg/l，辅助蛋白基因crp5p连接融合酶基因后10-hda产量可以达到246mg/l，均优于cn202211449654.3中所报道的重组蛋白cyp539a7*-f0cpr*-与辅助蛋白连接后，构建的重组菌作用反式-2-癸烯酸获得10-hda产量；特别的，上述技术方案构建的酿酒酵母工程菌制备10-hda的时间明显缩短于cn202211449654.3所报道的反应时间。cn202211449654.3中所涉及工程菌反应时间是48小时，上述技术方案中cyp153a33-cprbm3与酿酒酵母中辅助蛋白基因sil1p共表达质粒工程菌，0.5g/l癸烯酸反应36小时即可达到最大转化率和产物转化量，因此取得优异的技术效果。

16、2）上述技术方案制备的王浆酸，在3d表皮模型上证实，能显著增加神经酰胺总量、神经酰胺/蛋白的含量，提升率分别为35.37%、47.64%；还能提高脂肪酸总量、脂肪酸/蛋白的含量，提升率分别为27.51%、39%，因此它能够提高表皮层中脂质、神经酰胺含量，提高皮肤的屏障保护功能，改善受损屏障。

17、3）上述技术方案制备的王浆酸，在成纤维细胞模型上减少8-羟基脱氧鸟苷、γ-h2ax蛋白含量，抑制率分别为45.09%、47.25%，抑制dna损伤，防止损伤累积导致功能异常；能够降低细胞中线粒体活性氧含量、细胞的早期凋亡率，抑制率分别为70.71%、12.74%，提高线粒体三磷酸腺苷（atp）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nadph）含量，提升率分别为56.23%、15.13%，保护线粒体免受过氧化损伤，维持细胞内的能量供应及物质代谢；能延长端粒长度，相对t/s（tl）值上调31%，有效延缓衰老过程的细胞分裂复制导致的端粒缩短，加强对染色体末端的结构性保护，防止染色体末端发生降解或融合，细胞失去分裂活性走向衰老，进而防止皮肤衰老。

18、综上，上述技术方案制得的王浆酸及其制品，在皮肤修护、抗衰老等功能性的化妆品尤其是护肤品开发中具有广阔的应用前景。