一种重组毕赤酵母及其构建方法和在生产L-乳酸中的应用

本申请属于微生物发酵，尤其涉及一种重组毕赤酵母及其构建方法和在生产l-乳酸中的应用。

背景技术：

1、随着全球塑料污染问题日益加重，聚乳酸等生物可降解材料受到广泛关注和研究。l-乳酸作为合成聚乳酸的重要工业化学品，其需求量也随之不断增加。目前工业生产乳酸的方法主要分为化学合成法和微生物发酵法。其中化学合成法主要为乙醛氢氰酸法和丙烯腈法，通常生成外消旋乳酸，即dl-乳酸，光学纯度太低导致其难以满足应用要求。微生物发酵法通常采用玉米、小麦等淀粉为原料，经过淀粉酶和糖化酶将淀粉糖化，再用微生物发酵将糖转化为具有高光学纯度的l-乳酸，以应用于聚l-乳酸的工业合成。但是随着l-乳酸的需求量不断增加，以糖基碳源为底物的微生物发酵在未来可能会形成“与人争粮”的局面，从而威胁粮食安全。因此，寻求一种全新的绿色可持续的l-乳酸生产模式至关重要。

2、发展绿色低碳的人工光合成技术逐渐成为国内学者的重点研究方向。人工光合成就是利用太阳能等可再生能源，通过化学催化与生物催化，将水和二氧化碳转化合成“液态阳光”碳氢化合物的过程，可有效解决能源、环境和可持续发展问题。

3、因此，借鉴人工光合成理念，发展一种利用太阳能，以二氧化碳和水作为底物，高效生产l-乳酸的可持续生产模式具有重要意义。这种生产模式以二氧化碳替代了传统的糖基原料，一方面可以缓解粮食安全问题，另一方面实现了太阳能驱动二氧化碳到高附加值生物基化学品的升级转化，从而可以有效地解决能源和环境以及可持续发展问题。然而，目前有关如何利用“液态阳光”如甲醇、二羟丙酮和甘油等小分子作为底物生产l-乳酸的研究还鲜有报道。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组毕赤酵母及其构建方法和在生产l-乳酸中的应用，所述重组毕赤酵母可利用“液态阳光”有机小分子，如甲醇、二羟丙酮和甘油等作为底物进行发酵，从而获得高光学纯度的l-乳酸。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、一方面，本发明提供了一种重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母含有l-乳酸脱氢酶基因；

4、所述l-乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、第二方面，本发明提供了上述重组毕赤酵母的构建方法，包括如下步骤：

6、步骤1)将所述l-乳酸脱氢酶基因与初始表达载体、启动子和终止子连接，得重组表达载体；

7、步骤2)将所述重组表达载体转入毕赤酵母中，得所述重组毕赤酵母。

8、可选地，步骤1)中所述初始表达载体包括ppicza；

9、步骤1)中所述启动子包括gapp、pgi1p和tef1p中的任意一种；

10、步骤1)中所述终止子包括fbp1tt。

11、可选地，所述ppicza含有博来霉素抗性基因。

12、可选地，所述gapp的核苷酸序列如seq id no.2所示；

13、所述pgi1p的核苷酸序列如seq id no.3所示；

14、所述tef1p的核苷酸序列如seq id no.4所示。

15、可选地，所述fbp1tt的核苷酸序列如seq id no.5所示。

16、可选地，步骤1)将所述l-乳酸脱氢酶基因与初始表达载体、启动子和终止子连接完成后，还包括用限制性内切酶blpi进行酶切的步骤。

17、可选地，所述酶切的温度为35～40℃；

18、所述酶切的时间为25～35min。

19、第三方面，本发明提供了上述重组毕赤酵母在利用有机小分子发酵生产l-乳酸中的应用。

20、第四方面，本发明提供了一种利用有机小分子发酵生产l-乳酸的方法，包括如下步骤：

21、将上述的重组毕赤酵母接种至培养基中进行发酵培养，收集发酵产物，即得所述l-乳酸。

22、可选地，所述重组毕赤酵母的初始接种量为1～20od600。

23、可选地，所述培养基以有机小分子作为发酵底物。

24、可选地，所述有机小分子包括甲醇、二羟丙酮和甘油中的任意一种。

25、可选地，所述有机小分子的初始加入量为10～30g/l。

26、可选地，所述有机小分子的初始加入量独立地选自10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l中的任意值或任意两者之间的范围值。

27、可选地，所述培养基的ph为5～6。

28、可选地，所述发酵培养的温度为28～30℃。

29、可选地，所述发酵培养的方式包括摇瓶发酵培养或半连续发酵培养。

30、可选地，所述摇瓶发酵培养的时间为36～72h；

31、所述半连续发酵培养的时间为48～96h。

32、可选地，所述半连续发酵培养中的曝气量为36～48sl/h。

33、可选地，所述半连续发酵培养中的曝气量独立地选自36sl/h、38sl/h、40sl/h、42sl/h、44sl/h、46sl/h、48sl/h中的任意值或任意两者之间的范围值。

34、可选地，所述半连续发酵培养中的初始溶解氧含量不小于30％。

35、与现有技术相比，本发明包括以下有益效果：

36、(1)本发明将具有l-乳酸脱氢酶基因的表达载体导入毕赤酵母，通过同源重组的方式将目的基因插入毕赤酵母的基因组中，得到重组毕赤酵母。

37、(2)本发明提供的重组毕赤酵母菌株可利用“液态阳光”，如甲醇、二羟丙酮和甘油等小分子作为底物生产l-乳酸。所得的l-乳酸产量可达30g/l，转化率接近100％，光学纯度达99.5％以上。且上述生产模式以二氧化碳替代了传统的糖基原料，一方面可以缓解粮食安全问题，另一方面实现了太阳能驱动二氧化碳到高附加值生物基化学品的升级转化，从而可以有效地解决能源和环境以及可持续发展问题。

技术特征：

1.一种重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母含有l-乳酸脱氢酶基因；

2.权利要求1所述的重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述初始表达载体包括ppicza；

4.根据权利要求3所述的重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，所述ppicza含有博来霉素抗性基因；

5.权利要求1所述的重组毕赤酵母在利用有机小分子发酵生产l-乳酸中的应用。

6.一种利用有机小分子发酵生产l-乳酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种利用有机小分子发酵生产l-乳酸的方法，其特征在于，所述重组毕赤酵母的初始接种量为1～20od600。

8.根据权利要求6所述的一种利用有机小分子发酵生产l-乳酸的方法，其特征在于，所述培养基以有机小分子作为发酵底物；

9.根据权利要求6所述的一种利用有机小分子发酵生产l-乳酸的方法，其特征在于，所述培养基的ph为5～6；

10.根据权利要求6所述的一种利用有机小分子发酵生产l-乳酸的方法，其特征在于，所述发酵培养的方式包括摇瓶发酵培养或半连续发酵培养；

技术总结
本申请公开了一种重组毕赤酵母及其构建方法和在生产L‑乳酸中的应用，属于微生物发酵技术领域。本发明提供的重组毕赤酵母含有L‑乳酸脱氢酶基因；所述L‑乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的重组毕赤酵母可利用“液态阳光”甲醇、二羟丙酮或甘油等小分子作为底物生产L‑乳酸。所得的L‑乳酸产量可达30g/L，转化率接近100％，光学纯度达99.5％以上，表明本发明所构建获得的重组毕赤酵母可应用于生物发酵领域中高效生产高品质L‑乳酸。

技术研发人员：李灿,王旺银,张亚静
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15