一种高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法与流程

本发明具体涉及一种高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法，属于医药生物。

背景技术：

1、麦角菌(claviceps purpurea(fr.)tul.)属于真菌界，子囊菌门，核菌纲，肉座菌目，麦角菌科，麦角菌属；此菌寄生在黑麦、小麦、大麦、燕麦、鹅冠草等禾本科植物上。麦角为名贵中药材，据分析其所含的生物碱多达12种，分为麦角胺、麦角毒碱、麦角新碱3大类；麦角酸是天然麦角生物碱的基本结构的一部分；它作为合成一些半合成麦角生物碱的中间体大规模制造，已发现这些半合成麦角生物碱可作为药品，例如尼麦角林、甲基麦角新碱、麦角溴烟酯和二甲麦角新碱；不仅用于改善严重老年人心理健康问题，血管引起的视网膜问题上成果。

2、但现有的麦角菌株退化严重，且在选育上常采用微生物发酵法，而发酵法存在周期长，染菌风险高，且发酵液产物含量低，生产成本高，难以大规模工业化生产的问题；因此，为了解决现有麦角菌株的退化以及选育技术上的不足，亟待提出一种麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提出了一种高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法，利用发酵耐受代谢产物和诱变剂的复合诱变方式对原菌株进行突变，得到发酵能力更强的麦角菌菌株，提高了麦角酸的含量；且选育操作简易，菌种稳定、成本低，适合大规模工业化生产。

2、本发明的高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法，包括以下步骤：

3、第一步，获取发酵耐受代谢产物滤液，备用，

4、（1）取一支生长成熟的菌株斜面，刮取4cm2接种至装有60ml种瓶培养基的250ml摇瓶中，用高剪切分散乳化机使菌株与种瓶液混合均匀，剪切时间1~2分钟，摇床震荡培养温度24℃±1℃，培养时间40小时，得到种瓶菌丝液；

5、（2）将种瓶菌丝液转接种4ml至装有35ml发酵培养基的250ml摇瓶中，摇床震荡培养温度24℃±1℃，培养时间15天，得到发酵菌丝液；

6、（3）将发酵菌丝液用滤纸过滤出杂质物弃之，剩余上清即得到麦角菌发酵耐受代谢产物滤液；

7、第二步，分离培养基的配制，获取诱变单菌落，

8、（1）配制分离培养基时用80%的麦角菌发酵耐受产物滤液配制，水和滤液的比例为2：8，最后加入0.3%氯化锂诱变剂；

9、（2）刮取4㎝2的菌株斜面至装有5ml的0.85%~0.9%生理盐水的三角摇瓶内用高剪切分散乳化机使菌株与种瓶液混合均匀，剪切时间1~2分钟，制备成孢子悬浮液，用逐级稀释法分别稀释至10-3、10-4、10-5、10-6，分别吸取0.1ml孢子悬浮液，利用无菌划线法涂在装有分离培养基的培养皿中，培养温度24℃±1℃，培养时间15天，获取诱变单菌落；

10、第三步，诱变菌株斜面的制备，

11、选取标准为圆形微黄色表面微褶皱形状的单菌落，将单菌落移至斜面培养基中，用无菌技术划线法接种，培养温度24℃±1℃，培养时间7~10天，得到诱变菌株斜面；

12、第四步，诱变菌株斜面发酵能力考察，

13、（1）取一支生长成熟的菌株斜面刮取4cm2接种至装有60ml种瓶培养基的250ml摇瓶中，用高剪切分散乳化机使菌株与种瓶液混合均匀，剪切时间1~2分钟，摇床震荡培养温度24℃±1℃，培养时间40小时，得到种瓶菌丝液；

14、（2）将种瓶菌丝液转接种4ml至装有35ml发酵培养基的250ml摇瓶中，摇床震荡培养温度24℃±1℃，培养时间15天，得到发酵菌丝液；

15、第五步，取下生长成熟的发酵菌丝液，用高效液相法测含量。

16、进一步地，所述第一步和第四步中的种瓶培养基配比（1l）为：山梨醇5％，丁二酸1％，胰蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.03%，消沫剂0.8g，用水充分溶解均匀，调节ph至7.0；分别取60ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，条件为压力0.12±0.02mpa, 温度121℃～124℃，25~30分钟。

17、进一步地，所述第一步和第四步中的发酵培养基配比（1l）为：甘露醇10％，丁二酸3.5％，酵母粉0.05％，硫酸亚铁0.0025％，硫酸锌0.001％，玉米浆干粉2％，硫酸镁0.07%，消沫剂0.8g，全部用水充分溶解均匀，调节ph至7.0，分别取35ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，条件为压力0.12±0.02mpa, 温度121℃～124℃，25~30分钟。

18、进一步地，所述第二步中的分离培养基包括诱变菌株分离培养基和出发菌株分离培养基；所述诱变菌株分离培养基的配制方法为：配比（1l）马铃薯葡萄糖琼脂(pda)4.0％，酵母提取物0.05％，用80%的麦角菌发酵耐受代谢产物滤液配制，水和滤液的比例为2：8，加入0.3%氯化锂诱变剂，充分溶解均匀，得到诱变菌株分离培养基；所述出发菌株分离培养基的配制方法为：配比（1l）马铃薯葡萄糖琼脂(pda)4.0％，酵母提取物0.05％,全部用水溶解均匀，得到出发菌株分离培养基；将配制好的两种分离培养基分装于培养皿中，每个分装25ml，调节ph至7.0，湿热灭菌，条件为压力0.12±0.02mpa, 温度121℃～124℃，20~25分钟。

19、进一步地，所述第三步中的斜面培养基的配制方法：配比（1l）马铃薯葡萄糖琼脂(pda)4.0％，酵母提取物0.05％，全部用水溶解均匀；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装50ml，调节ph至7.0，湿热灭菌，条件为压力0.12±0.02mpa, 温度121℃～124℃，20~25分钟。

20、与现有技术相比，本发明的高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法，利用发酵耐受代谢产物和诱变剂的复合诱变方式对原菌株进行突变，得到发酵能力更强的麦角菌菌株，提高麦角酸的含量，发酵水平可达3.82g/l，部分批次可达到4.36g/l，比现有水平提高45.6%～51.2%；且选育操作简易，菌种稳定、成本低，适合大规模工业化生产，具有良好的经济效益和社会效益。

技术特征：

1.一种高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法，其特征在于，所述第一步和第四步中的种瓶培养基配比为：山梨醇5％，丁二酸1％，胰蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.03%，消沫剂0.8g，用水充分溶解均匀，调节ph至7.0；分别取60ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，条件为压力0.12±0.02mpa, 温度121℃～124℃，25~30分钟。

3.根据权利要求1所述的高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法，其特征在于，所述第一步和第四步中的发酵培养基配比为：甘露醇10％，丁二酸3.5％，酵母粉0.05％，硫酸亚铁0.0025％，硫酸锌0.001％，玉米浆干粉2％，硫酸镁0.07%，消沫剂0.8g，全部用水充分溶解均匀，调节ph至7.0，分别取35ml加入250ml摇瓶中，湿热灭菌，条件为压力0.12±0.02mpa,温度121℃～124℃，25~30分钟。

4.根据权利要求1所述的高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法，其特征在于，所述第二步中的分离培养基包括诱变菌株分离培养基和出发菌株分离培养基；所述诱变菌株分离培养基的配制方法为：配比马铃薯葡萄糖琼脂4.0％，酵母提取物0.05％，用80%的麦角菌发酵耐受代谢产物滤液配制，水和滤液的比例为2：8，加入0.3%氯化锂诱变剂，充分溶解均匀，得到诱变菌株分离培养基；所述出发菌株分离培养基的配制方法为：配比马铃薯葡萄糖琼脂4.0％，酵母提取物0.05％,全部用水溶解均匀，得到出发菌株分离培养基；将配制好的两种分离培养基分装于培养皿中，每个分装25ml，调节ph至7.0，湿热灭菌，条件为压力0.12±0.02mpa, 温度121℃～124℃，20~25分钟。

5.根据权利要求1所述的高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法，其特征在于，所述第三步中的斜面培养基的配制方法：配比马铃薯葡萄糖琼脂4.0％，酵母提取物0.05％，全部用水溶解均匀；配制好的斜面培养基分装于250ml茄子瓶中，每个茄子瓶分装50ml，调节ph至7.0，湿热灭菌，条件为压力0.12±0.02mpa, 温度121℃～124℃，20~25分钟。

技术总结
本发明公开了一种高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法，属于医药生物技术领域，包括以下步骤：第一步，获取发酵耐受代谢产物滤液，备用；第二步，分离培养基的配制，获取诱变单菌落；第三步，诱变菌株斜面的制备；第四步，诱变菌株斜面发酵能力考察；第五步，取下生长成熟的发酵菌丝液，用高效液相法测含量；本发明的高产麦角酸的麦角菌抗性突变选育方法，利用发酵耐受代谢产物和诱变剂的复合诱变方式对原菌株进行突变，得到发酵能力更强的麦角菌菌株，提高麦角酸的含量，发酵水平可达3.82g/L，部分批次可达到4.36g/L，比现有水平提高45.6%～51.2%；且选育操作简易，菌种稳定、成本低，适合大规模工业化生产，具有良好的经济效益和社会效益。

技术研发人员：毛宁,时圣凤,杨勇,伍雄辉,刘洪鹏,叶晖,张文浩,孟晓妍,张卫
受保护的技术使用者：福安药业集团烟台只楚药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16