一种质粒当中宿主DNA残留测定方法与流程

本发明属于生物制品质量控制中残留杂质检测，具体涉及一种质粒当中宿主dna残留测定方法。

背景技术：

1、质粒dna的提取纯化是现代分子生物学研究和应用中最基本且尤为关键的实验技术之一，高纯度的质粒dna是基因克隆、基因序列分析的重要前提，尤其是涉及核酸疫苗、基因治疗等对内毒素含量要求极高的研究领域尤为关键。

2、多种病毒载体被用于细胞和基因疗法，包括腺病毒、慢病毒和腺相关病毒等。这些载体大都使用hek293t细胞进行生产，残留dna就会作为杂质存在于载体终产品中。相对于细胞成品中的dna总量，宿主dna残留量(hcd)比例低，难以检测到准确数值。目前采用的方法还是检测病毒制剂中的宿主dna残留，通过严格控制病毒制剂中hcd量来保证细胞制剂中hcd不超标。但过于严格控制病毒制剂hcd使得工艺探索过程繁琐且成本昂贵。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种质粒当中宿主dna残留测定方法，以解决质粒当中宿主dna残留测定方法成本昂贵的问题。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种质粒当中宿主dna残留测定方法，包括如下步骤：

4、第一步、将大肠杆菌基因组dna溶液稀释，进行qubit4检测，使用qubit4荧光光度计定量测定基因组dsdna含量，作为标准品保存；

5、第二步、染料法荧光定量pcr：

6、步骤a1、使用te溶液稀释qubit4检测后的标准品，稀释后的浓度分别为1.1ng/μl，0.11ng/μl，0.011ng/μl，0.0011ng/μl，0.00011ng/μl，作为扩增模板制作标准曲线；质粒样品分别稀释成50ng/μl，10ng/μl，2ng/μl，同标准品一同进行荧光定量pcr反应；

7、步骤a2、荧光定量pcr扩增：

8、f引物序列：df1ggttaagctacctacttcttttgca；r引物序列：dr1agagcaagcggacctcataaag；

9、步骤a3、将样品ct值代入标准曲线方程中，计算样品的dna浓度。

10、进一步地，qubit4检测使用靶标选择性染料；qubittm4荧光计，厂家：赛默飞；货号q33238；dsdna靶标染料：厂家，赛默飞；货号：q32851。

11、进一步地，步骤a2中荧光定量pcr扩增反应体系如下所示：

12、模板dna1μl；

13、2xsybrqpcrmastermix10μl；

14、f引物df1(10μm)0.6μl；

15、r引物dr1(10μm)0.6μl；

16、ddh2oto20μl。

17、进一步地，步骤a2中荧光定量pcr扩增反应程序如下所示：

18、

19、进一步地，大肠杆菌基因组dna溶液通过如下步骤制备：

20、取菌种(不含质粒)接种lb无抗培养基中，置于摇床进行37℃培养约8h。取约4ml菌液离心收集菌体。

21、步骤s1、向菌体中加入200μl溶液ga，重悬细菌细胞，加入rnasea4μl，降解宿主rna；

22、步骤s2、加入20μlproteinasek溶液，振荡混匀以降解蛋白质；

23、步骤s3、继续加入220μl溶液gb，振荡混匀并置于70℃至沉淀溶解，得澄清透亮溶液；

24、步骤s4、继续加入220μl无水乙醇，振荡使充分沉淀，再次加入rnase a4μl，振荡并置于室温5-10min，使其充分反应降解rna；得到混合液；

25、步骤s5、将上述混合液加入套有收集管的cb3吸附柱中，离心，室温，30s，弃废液；

26、步骤s6、将步骤s5中得到的cb3吸附柱加入500μl溶液gd中，离心30s，弃废液；

27、步骤s7、将步骤s6中得到的cb3吸附柱加入600μl溶液pw中，离心30s，弃废液，重复2次充分漂洗；

28、步骤s8、将步骤s7中得到的cb3吸附柱置于收集管中，离心2min，弃废液；

29、步骤s9、将步骤s8中得到的cb3吸附柱置于室温直至彻底挥干后转移至离心管中，悬空滴加30μl溶液te(可适量少加te溶液)，置于室温放置5min，再置于离心2min，收集离心管溶液，可将收集到的溶液再次倒入离心柱中，再次离心提高回收率；得到大肠杆菌基因组dna溶液；

30、步骤s10、将得到的大肠杆菌基因组dna溶液使用紫外分光光度计测量浓度，以及凝胶电泳验证。

31、进一步地，所述溶液te中含有10mmtris-hcl，0.1mmedta，ph8.0。

32、进一步地，所述rnasea的浓度为100mg/ml；所述proteinasek溶液的浓度为20mg/ml。

33、进一步地，离心转速为12000r/min。

34、本发明的有益效果：

35、本发明中qubit4检测使用靶标选择性染料，只有与dna靶结合时才会发射荧光。它们比传统的紫外吸光法更准确。传统的紫外吸光法会因盐、溶剂、洗涤剂、蛋白质以及游离核苷酸等污染物的影响而过高估计样品浓度。荧光测量法也比紫外吸光法的灵敏度高很多，而qubit4荧光仪能够在显著降低的噪音下准确测量稀释的样品。

36、通过比较，自制染料法与商业化探针法测定质粒产品中宿主dna含量相差不大，自制染料法与商业化探针法都能有效测定质粒产品中大肠杆菌宿主dna含量，但是探针法试剂盒较昂贵，而本发明中染料法使用成本相对较低。

技术特征：

1.一种质粒当中宿主dna残留测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种质粒当中宿主dna残留测定方法，其特征在于，qubit 4检测使用靶标选择性染料。

3.根据权利要求1所述的一种质粒当中宿主dna残留测定方法，其特征在于，步骤a2中荧光定量pcr扩增反应体系如下所示：

4.根据权利要求1所述的一种质粒当中宿主dna残留测定方法，其特征在于，步骤a2中荧光定量pcr扩增反应程序如下所示：

5.根据权利要求1所述的一种质粒当中宿主dna残留测定方法，其特征在于，大肠杆菌基因组dna溶液通过如下步骤制备：

6.根据权利要求5所述的一种质粒当中宿主dna残留测定方法，其特征在于，所述溶液te中含有10mm tris-hcl，0.1mm edta，ph8.0。

7.根据权利要求5所述的一种质粒当中宿主dna残留测定方法，其特征在于，所述rnasea的浓度为100mg/ml；所述proteinase k溶液的浓度为20mg/ml。

8.根据权利要求5所述的一种质粒当中宿主dna残留测定方法，其特征在于，离心转速为12000r/min。

技术总结
本发明公开了一种质粒当中宿主DNA残留测定方法，属于生物制品质量控制中残留杂质检测技术领域；测定方法包括如下步骤：第一步、将大肠杆菌基因组DNA溶液稀释，进行Qubit 4检测，测定基因组dsDNA含量；第二步、染料法荧光定量PCR：步骤A1、使用TE溶液稀释Qubit 4检测后的标准品，作为扩增模板制作标准曲线；质粒样品稀释后同标准品一同进行荧光定量PCR反应；步骤A2、荧光定量PCR扩增；步骤A3、计算样品的DNA浓度。本发明中的自制染料法与商业化探针法都能有效测定质粒产品中大肠杆菌宿主DNA含量，但是探针法试剂盒较昂贵，而本发明中染料法使用成本相对较低。

技术研发人员：喻明军,崔康乐,纪世春,陈子辉
受保护的技术使用者：通用生物（安徽）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15