鉴定副结核分枝杆菌的双基因特异性引物、探针及应用

本发明涉及副结核分枝杆菌鉴定，更具体地说是涉及鉴定副结核分枝杆菌的双基因特异性引物、探针及应用。

背景技术：

1、近年来的研究表明，牛副结核病的流行严重影响畜牧业的持续健康发展，不仅造成奶牛乳房炎、结核性肠炎等疾病，还造成奶牛产乳量降低，更严重威胁着公共卫生安全。副结核病不仅对畜牧行业发展构成了威胁，同时也对动物性产品的生产有着不利的影响，除此之外也对人类健康具有潜在威胁，人类会因食用被副结核分枝杆菌污染的牛奶或奶制品而导致过敏性肠炎或溃疡性肠炎。因此，使用更为便捷、敏感、准确的检测方法，对副结核病的检测及防治极为重要。

2、检测副结核分枝杆菌时，利用is900序列作为靶基因可以显著提高检测的敏感性，而f57基因为map所独有，且f57基因可有效区分结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌及其他禽分枝杆菌。2013年，付志金根据map的f57序列针对梅花鹿副结核分枝杆菌建立了taqman pcr检测方法。2019年，a.k.schwalm使用实时pcr和液体培养对map is900序列进行研究。王春雨等根据副结核分枝杆菌特异性保守序列f57基因序列设计引物与探针用来检测鹿血中副结核分枝杆菌。2021年，王一新等人建立了map f57基因的sybr green i染料qpcr检测方法。但上述众检测方法均无法同时检测is900和f57。

3、因此，如何提供一种同时检测is900和f57的引物、探针是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明所建立的is900与f57双基因荧光定量检测方法，既避免了is900与某些分枝杆菌在特异性等方面的问题，又避免了f57基因可能产生不如is900基因灵敏度高的问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、鉴定副结核分枝杆菌的双基因特异性引物、探针，其特征在于，包括seq id no.1～seq id no.6所示的序列；

4、f57-f1：5’-gagccggtcccaggtgtgtt-3’，如seq id no.1所示；

5、f57-r1：5’-ccccagagcactcgtcagcc-3’，如seq id no.2所示；

6、f57-p1：5’-tggtcgtctgtgccagccgcccact-3’，如seq id no.3所示；且5’端连接有fam基团；

7、is900-f1：5’-gtggttgcggggtggtagac-3’，如seq id no.4所示；

8、is900-r1：5’-cgcacctactacgaccgaaa-3’，如seq id no.5所示；

9、is900-p1：5’-acggcttgggtgtggcgttttcctt-3’，如seq id no.6所示；且5’端连接有hex基团。

10、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的引物和探针在制备鉴定副结核分枝杆菌试剂盒中的应用。

11、作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种鉴定副结核分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括：

12、is900-f11μl、is900-r11μl、is900-p10.5μl、f57-f11μl、f57-r11μl，f57-p10.5μl、qpcr mix酶12.5μl，模板dna 5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl。

13、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了双重荧光引物和探针，其中，f57最低核酸检测量可达5copies/μl，is900最低核酸检测量可达2.5copies/μl，均有较高的敏感性；且本发明的探针引物组可从多种牛腹泻疾病的病原中只检测到副结核分枝杆is900、f57核酸，特异性良好。本发明操作简便、特异性强、灵敏度高、稳定性好，为副结核分枝杆菌的流行病学调查及快速诊断提供技术支撑。

技术特征：

1.鉴定副结核分枝杆菌的双基因特异性引物、探针，其特征在于，包括seq id no.1～seq id no.6所示的序列；

2.权利要求1所述的引物和探针在制备鉴定副结核分枝杆菌试剂盒中的应用。

3.一种鉴定副结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

技术总结
本发明公开了一种鉴定副结核分枝杆菌的双基因特异性引物、探针及应用，包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的序列；将所述序列应用于制备鉴定副结核分枝杆菌试剂盒中，本发明的探针引物组可从多种牛腹泻疾病的病原中只检测到副结核分枝杆IS900、F57核酸，特异性良好。本发明操作简便、特异性强、灵敏度高、稳定性好，为副结核分枝杆菌的流行病学调查及快速诊断提供技术支撑。

技术研发人员：周伟光,王永琴,希尼尼根,张志丹,王旭芬,侯琳,班亚星
受保护的技术使用者：内蒙古农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15