一种甜叶菊细胞悬浮培养方法与流程

本申请涉及甜叶菊细胞培养的，更具体地说，它涉及一种甜叶菊细胞悬浮培养方法。

背景技术：

1、甜叶菊的叶片中含有的甜叶菊糖苷为非糖质、无毒副作用、低热值的天然甜味剂，甜味为蔗糖的300倍。此外，甜叶菊糖苷还能防治糖尿病、肥胖症及小儿龋齿等，是此类患者的理想甜味剂。传统的甜叶菊繁殖方式主要有播种、扦插等，但以上繁殖方式存在播种成活率不高、扦插植株根系较弱等缺点。

2、目前在甜叶菊组织培养方面，其中愈伤组织培养以及不定芽诱导多倍体培养是相对成熟的、产量高、植株品质稳定的培养方式。另外还有的一种组织培养方式为原生质体培养，其培养步骤包括：以甜叶菊叶或幼茎组织培养所产生的愈伤组织用于培养获得细胞悬浮液，再转接至固体培养基以获得完整植株。在该过程中，通过调整悬浮细胞培养方式以使得胞内活性物质含量显著提高。相关技术中，例如，在对菊芋悬浮细胞培养时，通过添加茉莉酸甲酯、水杨酸或酵母提取物能够显著提高聚与细胞内的酚酸含量，例如槲皮素、儿茶素和绿原酸的含量升高；但同时也会使得部分酚酸的含量降低，例如：原儿茶酸、咖啡酸、表儿茶素、东莨菪内酯、3-羟基肉桂酸和芥子酸的含量降低；而4-羟基苯甲酸的含量没有变化。另外还有现有技术将脯氨酸或聚乙烯醇添加至悬浮细胞培养基内进行细胞培养，悬浮细胞中甜菊糖苷含量分别增加了3.7和4.7倍。

3、因此在悬浮培养时通过添加额外的物质能够进一步提高甜叶菊细胞内的活性物质含量。但是目前的技术中，甜叶菊细胞内甜菊糖苷含量的提高水平还是有限的。

技术实现思路

1、为了进一步提高细胞悬浮培养时甜叶菊细胞内甜菊糖苷的含量，本申请提供一种甜叶菊细胞悬浮培养方法。

2、本申请提供的一种甜叶菊细胞悬浮培养方法采用如下的技术方案：

3、一种甜叶菊细胞悬浮培养方法，包括以下步骤：

4、步骤一、以甜叶菊的外植体诱导得到愈伤组织；

5、步骤二、将愈伤组织转接至悬浮细胞液体培养基内培养7-13天，得到初代悬浮细胞；所述悬浮细胞液体培养基组分包括：ms培养基、0.7-1.3mg/lα-萘乙酸、2-4mg/l 6-苄基氨基嘌呤以及25-35g/l蔗糖；

6、步骤三、于所述悬浮细胞液体培养基内添加包括5-18mg/lβ-罗勒烯、5-20mg/l酚酸后继续黑暗培养7-15天，得到甜叶菊悬浮细胞。

7、通过采用上述技术方案，实验发现，在细胞悬浮培养过程中，添加β-罗勒烯和酚酸后能够显著提高甜叶菊细胞中甜菊糖苷的含量。酚酸作为一种含有苯环的有机酸，对细胞本身具有一定的作用，使得细胞通透性改变；此外，酚酸作为一种细胞信号分子参与调解植物的生长发育并刺激细胞做出应激反应，例如对紫外线伤害、机械损伤、病原微生物以及昆虫侵蚀做出应激反应。而β-罗勒烯是一种植物通讯信号分子。将两种物质一起加入至悬浮细胞液体培养基内用于甜叶菊悬浮细胞培养时，这两种物质协同发挥作用的原因可能为：通过刺激细胞并促进细胞信号传导，以调节相关活性物质代谢过程，进而显著提高甜叶菊细胞中甜菊糖苷含量。

8、可选的，步骤三中添加的β-罗勒烯为8-12mg/l。

9、通过采用上述技术方案，进一步调节β-罗勒烯的添加量，以进一步提高甜叶菊细胞中甜菊糖苷含量。

10、可选的，所述酚酸选自没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、水杨酸、3-羟基肉桂酸、芥子酸、4-羟基甲酸以及阿魏酸中的任意一种或几种。

11、可选的，所述酚酸选自没食子酸、原儿茶酸、绿原酸以及咖啡酸中的任意一种或几种。

12、可选的，所述酚酸为没食子酸和原儿茶酸，没食子酸和原儿茶酸的质量比为1:(0.3-0.7)。

13、通过采用上述技术方案，以进一步提高甜叶菊细胞中甜菊糖苷含量。在该方案中，以上酚酸为多酚羟基酚酸，多羟基酚酸和β-罗勒烯共同作用使得甜叶菊细胞中甜菊糖苷含量进一步提高。

14、可选的，所述外植体选自叶片、带腋芽茎段以及顶芽中的任意一种或多种。

15、进一步可选的，所述外植体为顶芽。以顶芽为外植体，得到的甜叶菊细胞中甜菊糖苷含量更高。

16、可选的，步骤一中得到所述愈伤组织的方法包括以下步骤：

17、获取外植体后消毒杀菌，随后置于愈伤组织培养基上，在22-25℃下光照培养至得到愈伤组织；其中，愈伤组织培养基的组分包括：ms培养基、1.5-2.3mg/l 6-苄基氨基嘌呤、0.7-1.2mg/lα-萘乙酸和2-4mg/l赤霉素。

18、可选的，光照培养时光照强度为1500-2500lx，光照时间为10-14h/d。

19、可选的，所述外植体消毒杀菌的方法包括以下步骤：将所述外植体分别以流动水、洗衣粉液、乙醇溶液以及次氯酸钠溶液洗涤后以无菌水洗涤，即得。

20、通过采用上述技术方案，充分地对外植体消毒杀菌，以充分保证无菌培养。

21、可选的，所述洗衣粉液中洗衣粉浓度为3-7wt％，所述乙醇溶液中乙醇浓度为60-80vol.％，所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠浓度为0.15-0.25wt％。

22、综上所述，本申请具有以下有益效果：

23、1、本申请选用植物细胞信号调节分子β-罗勒烯和酚酸调节细胞生长，以实现提高甜菊糖细胞中甜菊糖苷含量的目的。

24、2、本申请进一步优化β-罗勒烯在悬浮细胞液体培养基内的添加量为8-12mg/l，以进一步提高得到的甜叶菊细胞内甜菊糖苷含量。

25、3、本申请尝试了不同酚酸和β-罗勒烯的协同作用效果，最终删选得到酚酸选择为没食子酸、原儿茶酸、绿原酸以及咖啡酸中的任意一种时，得到的甜叶菊细胞内甜菊糖苷含量较高。而酚酸为两种物质时，其中具体为没食子酸和原儿茶酸且二者质量比为1:(0.3-0.7)时，得到的甜叶菊细胞的甜菊糖苷含量最高。

技术特征：

1.一种甜叶菊细胞悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种甜叶菊细胞悬浮培养方法，其特征在于，步骤三中添加的β-罗勒烯为8-12mg/l。

3.根据权利要求1所述的一种甜叶菊细胞悬浮培养方法，其特征在于，所述酚酸选自没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、水杨酸、3-羟基肉桂酸、芥子酸、4-羟基甲酸以及阿魏酸中的任意一种或几种。

4.根据权利要求1所述的一种甜叶菊细胞悬浮培养方法，其特征在于，所述酚酸选自没食子酸、原儿茶酸、绿原酸以及咖啡酸中的任意一种或几种。

5.根据权利要求1所述的一种甜叶菊细胞悬浮培养方法，其特征在于，所述酚酸为没食子酸和原儿茶酸，没食子酸和原儿茶酸的质量比为1:(0.3-0.7)。

6.根据权利要求1所述的一种甜叶菊细胞悬浮培养方法，其特征在于，所述外植体选自叶片、带腋芽茎段以及顶芽中的任意一种或多种。

7.根据权利要求1所述的一种甜叶菊细胞悬浮培养方法，其特征在于，步骤一中得到所述愈伤组织的方法包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的一种甜叶菊细胞悬浮培养方法，其特征在于，光照培养时光照强度为1500-2500lx，光照时间为10-14h/d。

9.根据权利要求7所述的一种甜叶菊细胞悬浮培养方法，其特征在于，所述外植体消毒杀菌的方法包括以下步骤：将所述外植体分别以流动水、洗衣粉液、乙醇溶液以及次氯酸钠溶液洗涤后以无菌水洗涤，即得。

10.根据权利要求9所述的一种甜叶菊细胞悬浮培养方法，其特征在于，所述洗衣粉液中洗衣粉浓度为3-7wt%，所述乙醇溶液中乙醇浓度为60-80vol.%，所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠浓度为0.15-0.25wt%。

技术总结
本申请涉及甜叶菊细胞培养的技术领域，具体公开了一种甜叶菊细胞悬浮培养方法。该方法包括以下步骤：步骤一、以甜叶菊外植体诱导得到愈伤组织；步骤二、将愈伤组织转接至悬浮细胞液体培养基内培养7‑13天，得到初代悬浮细胞；所述悬浮细胞液体培养基组分包括：MS培养基、0.7‑1.3mg/L α‑萘乙酸、2‑4mg/L 6‑苄基氨基嘌呤以及25‑35g/L蔗糖；步骤三、于所述悬浮细胞液体培养基内添加包括5‑18mg/L β‑罗勒烯、5‑20mg/L酚酸后继续黑暗培养7‑15天，得到甜叶菊悬浮细胞。以本申请方法培养得到的甜叶菊细胞中甜菊糖含量显著提高。

技术研发人员：王燕,王清华,熊炘,张丽瑜,巫恬静,姚睿,叶江成
受保护的技术使用者：浙江觅得优生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15