一种基于蛋白质偶联聚合体的生物发光酶联免疫分析方法

本发明属于免疫检测，具体涉及一种基于蛋白质偶联聚合体的生物发光酶联免疫分析方法。

背景技术：

1、酶联免疫分析技术(elisa)是一种常用于生物分析领域的方法，其原理是利用酶标记的抗体与目标分析物特异性结合，通过酶的催化反应产生可定量测量的信号。这种方法具有高度的灵敏度和特异性，广泛应用于临床诊断、药物研发和环境监测等领域。常用的酶标记包括辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，hrp)和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ap)等。

2、传统的酶联免疫分析技术需要使用单克隆抗体进行一抗、二抗等多步免疫反应，且标记的酶难以通过廉价的大肠杆菌表达系统获得。基于纳米荧光素酶(nano-luciferase，nluc)和纳米抗体(nanobody，nb)的生物发光酶联免疫分析技术解决了一部分传统酶联免疫分析方法的缺陷。纳米抗体是传统单克隆抗体的vhh区域，其分子量大概为14kda，具有易表达、稳定性强等优点。纳米荧光素酶是一种新型的生物发光酶，其特点之一是其小尺寸(约19kda)，这使得它能够轻松地在表达纯化。此外，纳米荧光素酶还具有极高的光稳定性和长寿命，这使得它成为应用于生物发光研究和生物成像的理想工具。生物发光酶联免疫分析技术使用纳米抗体-纳米荧光素酶融合蛋白进行检测，与传统的酶标记技术相比，纳米抗体-纳米荧光素酶融合蛋白可以通过大肠杆菌表达系统大规模表达纯化，避免了多步免疫反应，具有更高的灵敏度和稳定性。生物发光酶联免疫分析技术已广泛应用于生物学研究、药物筛选和环境监测等领域。

3、尽管生物发光酶联免疫分析技术在分析灵敏度和特异性方面相对于传统的酶联免疫分析技术有明显优势，但仍存在一些缺陷。其中包括：(1)催化底物价格高：纳米荧光素酶需要使用非天然化合物作为底物，例如coelenterazine-h、furimazin，这些化合物的价格昂贵；(2)多重标记困难：目前的方法往往仅能将单一纳米抗体和纳米荧光素酶融合蛋白应用于检测，限制了多重标记和多参数分析的实现。

技术实现思路

1、针对现有缺陷，我们发明了一种基于蛋白质偶联聚合体的生物发光酶联免疫分析方法，为实现本技术发明，本发明采用如下技术方案：

2、本发明的第一个目的是提供一种免疫聚合体蛋白，其是将支架蛋白mi3与荧光素酶和纳米抗体偶联获得。

3、优选地，所述支架蛋白mi3的氨基酸序列如seq id no.1第109-313位所示，所述荧光素酶为纳米荧光素酶，所述纳米抗体为真菌毒素纳米抗体。

4、优选地，所述真菌毒素纳米抗体为抗afb1特异性纳米抗体或/和抗ota特异性纳米抗体。

5、本发明的第二个目的是提供上述的免疫聚合体蛋白的制备方法，其包括如下步骤：构建、表达并纯化mi3的聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白；依次加入纯化后的聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白；充分结合后分离获取已偶联的组分。

6、优选地，所述聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白的体积摩尔浓度比为10:1-2:9-10；所述充分结合为4℃下结合12h；所述分离为通过凝胶过滤层析。

7、优选地，所述的纳米抗体-连接多肽融合蛋白为抗afb1特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白nb26-spytag，其氨基酸序列如seq id no.3所示，或/和抗ota特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白nb28-spytag，其氨基酸序列如seq id no.4所示。

8、优选地，所述的荧光素酶-连接多肽融合蛋白为纳米荧光素酶-连接多肽融合蛋白nluc-spytag，其氨基酸序列如seq id no.2所示，所述的聚合体-接头蛋白融合蛋白为spycatcher-mi3，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

9、本发明的第三个目的是提供一种生物发光酶联免疫试剂盒，其包括上述的免疫聚合体蛋白。

10、本发明的第四个目的是提供一种生物发光酶联免疫分析方法，为使用上述的免疫聚合体蛋白或上述的试剂盒进行检测。

11、本发明的第五个目的是提供上述的免疫聚合体蛋白、上述的试剂盒或上述的方法在检测真菌毒素中的应用。

12、优选地，所述真菌毒素为afb1和/或ota。

13、本发明的优点：

14、本发明降低了nluc底物的使用浓度，并成功地将抗afb1特异性纳米抗体和抗ota特异性纳米抗体与纳米荧光素酶融合，实现了多重标记。通过本发明提供的方法，可以将生物发光与酶联免疫结合，提高检测荧光强度、降低底物使用浓度并实现通用、可自由组合的多重偶联，从而更好地满足生物分析领域的需求。

技术特征：

1.一种免疫聚合体蛋白，其特征在于，是将支架蛋白mi3与荧光素酶和纳米抗体偶联获得。

2.根据权利要求1所述的免疫聚合体蛋白，其特征在于，所述支架蛋白mi3的氨基酸序列如seq id no.1第109-313位所示，所述荧光素酶为纳米荧光素酶，所述纳米抗体为真菌毒素纳米抗体。

3.根据权利要求2所述的免疫聚合体蛋白，其特征在于，所述真菌毒素纳米抗体为抗afb1特异性纳米抗体或/和抗ota特异性纳米抗体。

4.权利要求1所述的免疫聚合体蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建、表达并纯化mi3的聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白；依次加入纯化后的聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白；充分结合后分离获取已偶联的组分。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白的体积摩尔浓度比为10:1-2:9-10；所述充分结合为4℃下结合12h；所述分离为通过凝胶过滤层析。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的纳米抗体-连接多肽融合蛋白为抗afb1特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白nb26-spytag，其氨基酸序列如seq id no.3所示，或/和抗ota特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白nb28-spytag，其氨基酸序列如seq idno.4所示。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的荧光素酶-连接多肽融合蛋白为纳米荧光素酶-连接多肽融合蛋白nluc-spytag，其氨基酸序列如seq id no.2所示，所述的聚合体-接头蛋白融合蛋白为spycatcher-mi3，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

8.一种生物发光酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的免疫聚合体蛋白。

9.一种生物发光酶联免疫分析方法，其特征在于，使用权利要求1-3任一所述的免疫聚合体蛋白或权利要求8所述的试剂盒进行检测。

10.权利要求1-3任一所述的免疫聚合体蛋白、权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的方法在检测真菌毒素中的应用。

技术总结
本发明提供了一种基于蛋白质偶联聚合体的生物发光酶联免疫分析方法。所述蛋白质偶联聚合体为通过将支架蛋白mi3与荧光素酶和纳米抗体偶联获得的免疫聚合体蛋白。使用该免疫聚合体蛋白进行生物发光酶联免疫分析检测，可提高检测荧光强度、降低底物使用浓度并实现通用、可自由组合的多重偶联，从而更好地满足生物分析领域的需求。

技术研发人员：吴绍文,晏石娟,胥锦涛,黄文洁,李文燕
受保护的技术使用者：广东省农业科学院农业生物基因研究中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15