用于粪菌移植的肠易激综合征肠道微生物标志物及其应用的制作方法

本发明涉及微生物，具体涉及用于粪菌移植的肠易激综合征肠道微生物标志物及其应用。

背景技术：

1、肠易激综合征(ibs)是一种相对常见的功能性胃肠道疾病，是由遗传，心理和环境因素之间的复杂相互作用引起的腹痛和排便习惯的改变的一组综合性症状，但没有可检测到的结构或生化异常，严重影响了患者工作和生活质量。近年来，随着对肠道微生态的研究取得丰富进展，肠道微生态调节有望成为治疗ibs的一种新的有效疗法。

2、粪便微生物群移植(fmt)是将健康供体的胃肠道(gi)菌群转移到胃肠道菌群失调的患者肠道内。作为可能是一种有前途的治疗肠易激综合征的方法，先前的一些研究中报道fmt减轻了ibs患者的症状并改善了他们的生活质量，而在其他的研究中没有发现优于安慰剂的疗效。已有的研究表明，并非所有ibs患者在fmt治疗前后都存在微生物组变化，不同的ibs表型亚组在其肠道微生物群中表现出差异，并且其干扰严重程度因亚组而异。因此，fmt的治疗潜力可能因ibs患者的菌群差异而不同。研究与fmt治疗反应相关的患者菌群表型差异，是fmt针对ibs进行有效治疗的前提，同时可望实现基于菌群表型的分群而进行精准的治疗；而目前在本领域，对于这方面的研究仍然很有限。

3、针对以上问题，亟需研究出一种适合进行粪菌移植的肠易激综合征肠道微生物标志物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，本发明旨在提供用于粪菌移植的肠易激综合征肠道微生物标志物及其应用，通过本发明方法得到的上述标志物在使用时微生物标志物具有特异性高、敏感性强、检测对象采集处理简易、无侵害性、成本低等优点；该标志物为有针对性地选择ibs患者进行fmt治疗提供了参考。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、用于粪菌移植的肠易激综合征肠道微生物标志物，包括粪杆菌属、乳酸杆菌属、小杆菌属、巨单胞菌属、韦荣氏球菌属、多尔氏菌属和拟杆菌属。

4、优选的，所述的粪杆菌属、乳酸杆菌属、小杆菌属、巨单胞菌、韦荣氏球菌属菌群的相对丰度高于无应答者；多尔氏菌属、拟杆菌属的相对丰度低于无应答者；

5、所述相对丰度的计算方式为组间差异显著物种分析，通过采用线性判别分析进而来估算各个组分丰度对各组肠道菌群之间的差异效果的影响大小。

6、优选的，所述的微生物标志物的制备方法包括步骤

7、s1.收集和检测粪便

8、实验组患有ibs的患者被要求每天早上空腹状态下用水口服5粒粪菌胶囊，纵向收集实验组患者在fmt治疗前、fmt治疗首疗程后1月、治疗后3个月的粪便样本进行粪便检测，并通过对数据分析比较治疗应答者和治疗无应答者肠道菌群组成差异；

9、s2.菌群分析；

10、s3.肠道微生物筛选

11、通过采用线性判别分析估算各个组分丰度对各组肠道菌群之间的差异效果的影响大小，找到在各组之间肠道菌群在丰度上具有显著性差异的物种，设置ldascore的筛选值为4.0，筛选出在治疗应答者和治疗无应答者肠道中高丰度的且差异最为显著的细菌作为标记物。

12、优选的，步骤s1所述的粪菌胶囊的制备过程包括

13、1.收集新鲜供体粪便不少于100g，2小时内用0.9％生理盐水500ml稀释；

14、2.然后用肠道细菌萃取器提取肠道细菌；

15、3.将提取的肠道细菌溶液以4000r/min离心10min，弃上清保留沉淀物；

16、4.沉淀充分搅拌后，加入1％的亿可力，冻干，装入1号胶囊内，放入-80℃冰箱保存；得到胶囊中菌粉重量平均为：0.185g，含菌量≥1.2x1012/粒的粪菌胶囊。

17、优选的，步骤s1所述的粪便检测过程包括

18、s121.使用powersoil dna isolation kit分离试剂盒从0.25g粪便样本中提取总dna；

19、s122.设计引物，使用引物对提取的总dna进行pcr扩增；

20、s123.pcr扩增产物使用建库试剂盒进行文库构建；

21、s124.最后illumina miseq平台测序，测序策略为pe300，测序原始序列上传至ncbi的sra数据库。

22、优选的，步骤s122所述的引物设计过程包括

23、(1)使用引物704f和765r扩增细菌16sr dna基因的v4-v5双可变区；

24、其中，所述704f为上游引物，序列信息如seqidno.1所示；765r为下游引物，序列信息如seqidno.2所示；

25、seqidno.1:gtacggtgaartgcgyaga

26、seqidno.2:ctgttygctccccacgctttc；

27、(2)在引物上游和下游引物的5’末端各添加8bp的barcode序列，合成带有barcode序列的引物。

28、优选的，步骤s122所述的pcr扩增过程中

29、(1)反应体系为：pcr反应总体系为25μl，包括：12.5μl kapa 2g robust hotstart ready mix、1μl forward primer、1μl reverse primer、5μl dna，5.5μl dd h2o；

30、其中，所述forward primer和reverse primer的浓度均为5μm，所述加入的dna总量为30ng；

31、(2)反应参数为：95℃预变性5min；95℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸45s，28个循环；72℃延伸10min；

32、pcr产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小，并用agencourtampurexp核酸纯化试剂盒纯化。

33、优选的，步骤s2所述的菌群分析过程包括

34、s21.数据预处理

35、s22.alpha多样性分析

36、利用alpha多样性分析法分析各组ibs患者盲肠内容物的稀释曲线、shannon指数曲线、等级丰度曲线，得到有应答肠易激综合征患者与无应答肠易激综合征患者肠道微生物的alpha多样性分析结果；

37、s23.beta多样性分析

38、用主坐标分析法将n个样品表示成n个点，使点间的欧式距离的平方等于原来的差异数据，实现定性数据的定量转换，从多维数据中提取出最主要的元素和结构；通过主坐标分析实现多个样品的分类，进一步展示样品间物种多样性差异；两个样品之间的距离越近，表示这两个样品肠道菌群之间的组成越相似；使用r语言工具绘制pcoa分析图，得到有应答肠易激综合征患者与无应答肠易激综合征患者肠道微生物的beta多样性分析结果；

39、s24.物种分类学分析

40、通过将otu的代表序列与微生物参考数据库进行比对可得到与每个otu所相对应的物种分类信息，进而各对样品的肠道菌群在各水平的物种组成进行统计，利用qiime软件生成不同分类水平上的肠道菌群内物种的丰度表，再通过r语言工具对样品在各分类学水平下的肠道菌群物种结构进行绘制；

41、其中，所述各水平包括门，纲，目，科，属，种。

42、优选的，步骤s21所述的数据预处理过程包括

43、s211.测序数据经过qiime1软件根据barcode序列拆分样本，对数据进行过滤、拼接；

44、s212.拼接后使用vsearch软件去除长度小于230bp的序列，并根据gold database数据库用uchime方法比对去除嵌合体序列；

45、s213.最后使用vsearch软件uparse算法对优质序列进行otu聚类，序列相似性阈值为97％；

46、s214.将otu代表序列使用blast算法与silva138数据库进行比对，e-value阈值设置为1e-5，得到每个otu对应的物种分类信息；

47、s215.通过归类操作，对所有序列进行otu划分，对97％相似水平下的otu进行生物信息统计分析。

48、用于粪菌移植的肠易激综合征肠道微生物标志物的应用，所述微生物标志物用于粪菌移植治疗和研发改善肠易激综合征的微生物制剂。

49、本发明的有益效果是：本发明公开了用于粪菌移植的肠易激综合征肠道微生物标志物及其应用，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：

50、1.本发明提出了一种用于粪菌移植的肠易激综合征肠道微生物标志物的方法，本方法通过利用对粪菌移植治疗有应答的患者和无应答患者肠道微生物的差异，筛选出了适于用于进行粪菌移植治疗的肠易激综合征有关的肠菌标记物；

51、2.本发明筛选并提取了一种用于粪菌移植的肠易激综合征肠道微生物标志物，包括粪杆菌属(faecalibacterium)、乳酸杆菌属(lactobacillus)、小杆菌属(dialister)、巨单胞菌属(megamonas)、韦荣氏球菌属(veillonella)、多尔氏菌属(dorea)、拟杆菌属(bacteroides)；上述标志物的提取和筛选为诊断适宜菌群移植的肠易激综合征患者提供了参考，另外，可用于研发改善肠易激综合征的微生物制剂，在使用时，上述微生物标志物具有特异性高、敏感性强、检测对象采集处理简易、无侵害性、成本低等优点。