一种用于检测汞的可视化生物传感器及其应用

本发明涉及生物传感器，具体涉及一种用于检测汞的可视化生物传感器及其应用。

背景技术：

1、汞(hg)是全球环境污染物中常见的毒性最强的重金属之一，在空气、水体和土壤等自然环境中广泛分布，其特点是具有持久性、生物蓄积性和神经毒性，即使在低剂量暴露下也可能对人类和哺乳动物的中枢神经系统造成不可逆转的伤害。进入人类食物链中的无机汞(ihg)的甲基化和生物蓄积会产生甲基汞(mehg)，甲基汞是毒性最强的一类有机化合物，其较强的脂溶性使得甲基汞能通过血脑屏障造成中枢神经系统损伤，自二十世纪中叶以来，甲基汞暴露对人类健康造成了相当大的损害。

2、鉴于汞污染的广泛性和对人类健康的严重危害，实现对汞的快速检测成为防止汞污染的关键问题。汞污染的传统检测方法主要依赖于大型仪器，包括气相色谱-质谱联用仪(gc-ms)、高效液相色谱(hplc-ms)和电感耦合等离子体质谱(icp-ms)等。这些方法虽然精确灵敏，却需要复杂的前处理且耗时长，需要专业人员以及高昂的设备资金、操作复杂等缺点。因此，开发一种便捷、廉价易操作的新型汞检测方法变得尤为迫切。

3、生物传感器作为检测重金属污染的一种重要手段能够有效避免传统大型仪器的限制。近些年来微生物传感器在污染物的生物可利用度检测和毒性评估上迅速发展。与传统的检测方法和其他类型传感器相比，微生物传感器具有种类多、操作简便、繁殖能力强、适应性强等优点，越来越多地被开发为具有检测能力的传感器。但灵敏度低和特异性差限制了其实际应用。

4、金属调控蛋白最早在细胞膜上发现，其活性依赖于相应金属离子的浓度。merr家族是目前存在最广泛且唯一利用转录激活机制对金属离子进行调控的蛋白家族，以最先发现可以特异性响应hg2+的merr蛋白命名。在没有hg2+存在的情况下，merr蛋白以阻遏的形式结合在启动子-10和-35区域，抑制下游基因的表达；在hg2+存在的情况下，hg2+被merr蛋白识别后，蛋白质构象发生变化，使得与之结合的启动子dna结构发生扭曲，更易被rna聚合酶识别，从而激活下游基因转录。基于此可将下游基因替换为可检测的报告基因，构建野生型汞全菌生物传感器。

5、现有技术中，大部分用来检测汞的全菌生物传感器检测限较高，有研究人员使用大肠杆菌dh5α菌株,通过使用荧光增强响应的gfp突变体作为报告模块，开发汞生物传感器，检测限为1.3nm(约260ng/l)，远高于本专利0.313ng/l的检测限；对于汞传感器检测的可视化，研究人员使用大肠杆菌top10菌株，紫罗兰素做为报告基因，反应所需时间为5小时，时间较长。(wang,d.；zheng,y.；wei,l.；wei,n.；fan,x.；huang,s.；xiao,q.a signal-amplified whole-cell biosensor for sensitive detection of hg2+based on hg2+-enhanced reporter module.journal of environmental sciences 2020,96,93–98.guo,y.；hui,c.；liu,l.；chen,m.；huang,h.development of a bioavailable hg(ii)sensingsystem based on merr-regulated visual pigment biosynthesis.sci rep 2021,11(1),13516.)

6、由于在实际样品检测中对hg2+不够灵敏，影响了汞全菌生物传感器的广泛应用。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明的目的之一在于提供一种对hg2+和/或mehg+具有高荧光响应强度的merr突变体，所述merr突变体命名为m4-1，其核苷酸序列如seq id no：1所示。

2、本发明的目的之二在于提供一种含有如上所述的merr突变体的重组载体。

3、优选的，该重组载体为psb1k3-merr-gfp重组载体，其以psb1k3-mrfp1质粒为载体骨架，使用报告基因绿色荧光蛋白gfp和merr突变体m4-1为基本元件构建。

4、优选的，所述重组载体还包括merr特异性启动子pmert以及组成型启动子j23109。

5、本发明的目的之三在于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的merr突变体m4-1，或含有如上所述的重组载体。

6、优选的，所述宿主细胞为e.coli judei感受态细胞。

7、本发明还提供上述merr突变体和/或重组载体和/或宿主细胞在检测hg2+和/或mehg+含量中的应用。

8、本发明的有益效果在于：

9、本发明以野生型merr为模板进行易错pcr，构建库容量107～8的随机突变体文库，运用流式细胞仪对merr突变体文库进行筛选，在四轮突变体建库及阳性筛选后，最终筛选得到在低浓度下能够对hg2+和mehg+具有更高荧光响应强度的突变体，命名为m4-1。

10、利用对hg2+响应的野生型重金属调控蛋白merr突变体m4-1作为传感元件，绿色荧光蛋白gfp为报告元件，根据合成生物学载体构建标准得到重组载体，以及包含该重组载体的宿主细胞，该重组载体和宿主细胞可以作为汞生物传感器，对汞进行专一检测，灵敏度高。

11、实验验证较于野生型生物传感器对hg2+和mehg+的响应情况，本发明提供的基于merr突变体m4-1构建的汞全菌生物传感器对hg2+的响应浓度范围为0～70ng/l，检测限313pg/l；对mehg+的检测限为0.098μg/l，实现了从对甲基汞不响应到响应到跨越。

12、本发明最终筛选得到的merr突变体m4-1能对环境、食品、生物体安全标准范围内的汞进行检测，同时得到的可视化生物传感器2gc实现了对纳克级汞浓度检测的可视化，无论是在汞污染检测监测还是生物体监测方面都具有应用潜力。

技术特征：

1.一种merr突变体，所述merr突变体命名为m4-1，其核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.如权利要求1所述的merr突变体在检测hg2+和/或mehg+含量中的应用。

3.一种含有如权利要求1所述的merr突变体的重组载体。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，该重组载体为psb1k3-merr-gfp重组载体，其以psb1k3-mrfp1质粒为载体骨架，使用第一报告基因绿色荧光蛋白gfp和merr突变体m4-1为基本元件构建。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包括merr特异性启动子pmert以及组成型启动子j23109。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，还包括连接在所述第一报告基因后的第二报告基因，所述第二报告基因与第一报告基因绿色荧光蛋白gfp相同，所述第一报告基因和第二报告基因之间插入一段序列，该序列为2gm、2gc中的任意一种，其中2gm的核苷酸序列如seq id no:4所示，2gc的核苷酸序列如seq id no:5所示。

7.如权利要求3-6任一项所述的重组载体作为汞诱导型生物传感器在检测hg2+和/或mehg+含量中的应用。

8.一种宿主细胞，其特征在于，含有如权利要求1所述的merr突变体m4-1，或含有如权利要求3-6任一项所述的重组载体。

9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为e.colijudei感受态细胞。

10.如权利要8所述的宿主细胞作为汞诱导型生物传感器在检测hg2+和/或mehg+含量中的应用。

技术总结
本发明涉及生物传感器技术领域，具体涉及一种用于检测汞的可视化生物传感器及其应用。该可视化生物传感器以对Hg<supgt;2+</supgt;和/或MeHg<supgt;+</supgt;具有高荧光响应强度的MerR突变体m4‑1为传感元件，绿色荧光蛋白GFP为报告元件对汞进行可视化检测。本发明提供的基于MerR突变体m4‑1的汞全菌生物传感器，具有灵敏度高、对汞检测专一的特点，同时能对甲基汞响应，在环境、食品、生物体的汞检测上具有极高的应用潜力。

技术研发人员：陈少鹏,朱凯丽,赵国平,鲍凌志,马洁
受保护的技术使用者：中国科学院合肥物质科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16