一株枯草芽孢杆菌及产纳豆激酶的应用的制作方法

本发明涉及工业微生物发酵，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其在制备溶栓产品中的应用。

背景技术：

1、纳豆激酶(nattokinase,nk)是由纳豆发酵菌枯草芽孢杆菌分泌表达的一种能溶解血栓的纤溶酶，该酶为碱性丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸组成的单链多肽，具有纤维蛋白溶解活性。随着对nk研究的不断深入，nk产业展现出了巨大的商业价值和广阔的应用前景，如nk作为辅助溶栓的保健品药物，现已在发达国家广泛使用，2014年我国监管部门也将纳豆激酶列入保健产品的功能性成分。纳豆激酶的活性是衡量纳豆激酶产品品质的主要标准，在纳豆激酶工业化生产并药用过程中，酶活指标尤为关键。日本产的纳豆激酶由纳豆枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis natto)发酵纳豆中提取，活性为10000-22000fu/g，相当于67000-147400iu/g，欧盟食品和安全局确定正常纳豆激酶原料的活性参数是20000～28000fu/g。

2、枯草芽孢杆菌是nk的天然表达菌种，可实现可溶性表达。由于使用不同菌株发酵产生纳豆激酶的量和活性有很大的差别，因此选择合适的菌株对大规模生产是至关重要的。例如专利申请cn202011205243.0公开了一种枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种菌株、纳豆发酵饮品及其制备方法，其分泌的纳豆激酶酶活达到1500iu/ml；专利申请cn202010037155.8公开了一种枯草芽孢杆菌及其在生产纳豆激酶中的应用，纳豆激酶酶活高达12000iu/ml；专利申请cn202110522387.7公开了一株高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用，其发酵所得纳豆激酶的酶活约为23000iu/ml，应用到豆类与谷物复配进行固体发酵，发酵制品中纳豆激酶的酶活可达30000iu/g。从目前的纳豆激酶分泌菌株的研究情况来看，纳豆激酶的产量和活力还有待继续提高，以达到工业化功能性食品和药物的标准，所以还需筛选获得高产纳豆激酶酶活的菌株。

技术实现思路

1、本发明提供了一种从纳豆中筛选得到枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)mq013-26，于2023年03月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2023432；保藏地址：中国武汉大学。

2、本发明提供一种发酵液，由上述枯草芽孢杆菌发酵而来。

3、本发明提供的枯草芽孢杆菌或其发酵液的用途，可用于制备抑制血栓形成或溶解血栓的药品、保健品、食品、饮料、添加剂、饲料中的一个或多个。

4、本发明提供的枯草芽孢杆菌可以在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵。

5、优选技术方案中可同化的碳源选自淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘油、豆油、山梨醇、甘露醇之一或者任意几种的组合；优选为葡萄糖。

6、优选技术方案中可同化的氮源选自酵母提取物、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐之一或者任意几种的组合；优选为蛋白胨。

7、优选技术方案中发酵培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或任意几种的组合；优选为磷酸氢二钾、硫酸镁。

8、本发明提供利用枯草芽孢杆菌发酵制备纳豆激酶粉的制备方法，枯草芽孢杆菌进行液体发酵，发酵上清添加麦芽糊精，喷雾干燥，得到纳豆激酶粉。

9、优选技术方案中，麦芽糊精按质量体积比8％加入上清液，喷雾干燥机进行干燥，控制进料温度为120℃，控制出风温度为50℃，收集粉体经40目过筛机过筛分装。

10、本发明提供利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆发酵产品的制备方法，以豆类为原料，将豆类浸泡6-24小时后，进行蒸煮，然后接种所述枯草芽杆菌菌株，于37-41℃，发酵12-96小时。优选技术方案中，豆类为大豆。

11、有益效果：

12、本发明筛选得到一株高产纳豆激酶枯草芽孢杆菌bacillus subtilis mq013-26，该菌株液态发酵所得纳豆激酶酶活高于40000iu/ml，高酶活为纳豆激酶规模生产和商业应用奠定良好基础。该菌株发酵液通过喷干可获得高酶活的纳豆激酶粉产品，也可用于制作高纳豆激酶活性的豆类发酵制品。

技术特征：

1.一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)mq013-26，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2023432，保藏日期为2023年03月29日。

2.一种发酵液，其特征在于：通过权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵而来。

3.一种权利要求1-2中任一项所述的枯草芽孢杆菌或其发酵液的用途，其特征在于：用于制备抑制血栓形成或溶解血栓的药品、保健品、食品、饮料、添加剂、饲料中的一个或多个。

4.一种权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述的发酵在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵。

5.如权利要求4所述的发酵方法，其特征在于：

6.如权利要求4所述的发酵方法，其特征在于：

7.如权利要求4所述的发酵方法，其特征在于：

8.利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌发酵制备纳豆激酶粉的制备方法，其特征在于：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

10.利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌发酵制备大豆发酵产品的制备方法，其特征在于：

技术总结
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MQ013‑26，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2023432。该菌发酵液所得纳豆激酶酶活高于40000IU/mL，通过喷干可获得高酶活的纳豆激酶粉产品，也可用于制作高纳豆激酶活性的大豆发酵制品。

技术研发人员：叶世豪,沈威,陈辅辰,秦田明,夏辛珂,张恒
受保护的技术使用者：湖北美琪健康科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16