葡萄蜡酯合成酶VvWSD1及其在植物抗寒遗传改良中的应用

本发明涉及植物基因工程，特别涉及一种葡萄蜡酯合成酶vvwsd1及其在植物抗寒遗传改良中的应用。

背景技术：

1、当植物受到低温胁迫时，细胞膜由液晶态转成凝胶态，进而膜透性增大，导致电解质失衡，使细胞代谢紊乱，影响其正常生长发育甚至导致死亡。同时低温胁迫下，植物体内的自由基增多，而活性氧(reactiveoxygen species,ros)的增加会使植物膜脂过氧化程度加剧。低温胁迫还会直接或者间接地影响着光合作用，使叶绿素合成酶的活性降低，影响植物光合作用。植物在长期进化过程中形成了一套完整的低温应答机制，通过调节基因表达、调节渗透物质合成和抗氧化酶活性以及其他信号通路之间的相互作用，提高自身对低温胁迫的适应。

2、植物表皮蜡质是陆地植物地上部分与空气接触的用于抵抗外界生物及非生物胁迫的疏水屏障，分为外蜡质层和内蜡质层两种，二者通过共价键形成复合结构。植物表皮蜡质主要由超长链式脂肪酸组成，在合成vlcfas的过程中会附带产生大量衍生物质(烷、醇、醛和酯等)，此外，还会包含有一些微量的三萜类化合物和次生代谢产物。蜡质的生物合成是在植物表皮细胞中进行的，由多个基因及其所编码的酶或转运蛋白协同完成，可分为脂肪酸前体的形成、超长链脂肪酸(verylongchainfattyacids,vlcfas)和蜡质产物合成几个阶段。已有研究表明，表皮蜡质在响应环境胁迫、维持水分平衡、抵御病虫侵害、防止机械损伤、减弱紫外线辐射和保障果实品质等方面具有重要作用。

3、有文献报道，拟南芥中wsd基因家族共有11个成员，其中wsd1基因主要编码蜡酯合成酶，在拟南芥对环境胁迫响应中起着非常重要的作用。干旱胁迫下植物体内wsd1的表达上调，同时wsd1突变体叶片中蜡酯含量降低，叶片失水增加，表明wsd1在植物干旱胁迫下蜡质的积累过程中起重要作用，提高了植株的抗旱能力。紫花针茅wsd1蛋白第239位苏氨酸的正向选择促进了叶片蜡酯的合成，进而提高了紫花针茅的抗旱性。同时干旱胁迫还可以显著诱导葡萄果实vvwsd1(vit_15s0046g00490)基因的表达，提高脂肪蜡含量。研究发现，低温处理21天的葡萄果实中的蜡质化合物(包括三萜、脂肪酸、伯醇、酯和醛)的含量及蜡质合成相关基因(如cer2、cer3、kcs2、wsd1)表达量明显增加。综合看来，目前对于wsd基因的研究主要集中在抗旱响应和果实保鲜方面，在温度胁迫应答中的作用鲜见报道。因此研究其抗性作用机制对果树遗传改良具有重要意义。

4、葡萄(vitisvinifera)是一种多年生藤本植物，用途广泛，既可以鲜食，也可以酿制成葡萄酒，同时叶、根、果实还可以入药。目前我国主要种植品种为欧亚葡萄品种和欧美杂交葡萄品种，对生物胁迫和非生物胁迫的抗性较差，所以冬季低温出现的冷害、冻害以及春季的抽条、霜冻对葡萄产业造成了严重影响，一些地区在冬季被迫进行深沟栽植、地面实埋等防冻措施，但这些措施不仅对树体造成损伤，影响葡萄品质，还会产生大量扬尘，对生活的环境造成污染，因此绿色科学提高葡萄的抗寒性已经成为我国葡萄产业发展亟待解决的重大问题。因此，克隆葡萄抗寒相关基因，对葡萄栽培品种进行耐寒性改良和种质资源选育，具有重要的理论意义和应用价值。

5、当植物遭遇低温胁迫时，体内会作出一系列的防御反应，通过各种调控途径抵御低温对自身造成的伤害。随着分子生物学的快速发展，植物中一部分抗寒基因已确定，例如以cbfs(crt/drebindingfactors)转录因子为核心，以rd29a、cor15a等作为cbfs下游调控基因冷信号的调控网络。基于以上研究基础，我们选取vvcbf1、vvcbf2、vvcbf3、vvcor15a、vvkin2、vvrd29a这六个基因作为实施例8中的冷相关基因。

技术实现思路

1、本发明提供了葡萄蜡酯合成酶vvwsd1在调控植物表皮蜡质合成以及抗寒遗传改良中的应用，技术方案如下：

2、第一方面，从葡萄中克隆得到一个基因vvwsd1，核苷酸序列为seq id no.1所示，其编码的蛋白质序列为seq id no.2所示，该基因包含1542bp的开放阅读框，编码514个氨基酸。vvwsd1的分子式组成为c4710h7877n1545o1970s323，预测的分子量为57.5kda，等电点为9.05，不稳定系数为39.26。

3、第二方面，通过qrt-pcr技术分析了低温处理不同时间后vvwsd1基因的相对表达量以及葡萄不同组织器官vvwsd1基因的相对表达量，结果表明vvwsd1受低温诱导表达上调，在12h时表达量最高，同时在成熟叶和果实中表达量显著。此外，对低温处理前后过表达vvwsd1转基因植株的表型及相关抗寒生理指标进行分析，结果表明：在低温胁迫条件下，与野生型相比，过表达vvwsd1转基因植株表现出明显的低温耐受表型。同时正常条件下，野生型和过表达vvwsd1转基因植株的生理指标没有显著区别；在低温胁迫条件下，过表达vvwsd1转基因植株中的mda、h2o2和o2·-含量明显低于野生型，而脯氨酸的含量明显高于野生型，表明过表达vvwsd1能够减弱转基因材料细胞膜脂过氧化，调节渗透物质积累，正向调控葡萄的抗寒性。

4、第三方面，通过vigs沉默技术和农杆菌瞬时转化技术获得了ptrv2-vvwsd1葡萄瞬时沉默叶片，低温处理后发现，ptrv2-vvwsd1葡萄叶片表皮蜡质尤其是蜡酯类及烷烃类含量明显减少，且低温胁迫下降低更为显著，表明vvwsd1能够促进葡萄叶片表皮蜡质积累。

5、第四方面，通过构建vvwsd1基因的植物过表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将基因导入植株中，获得的转基因植株具有提高植株抗寒性的功能。

6、本发明具有如下优点：本发明的葡萄蜡酯合成酶vvwsd1通过调控表皮蜡质合成参与葡萄低温胁迫的应答，为葡萄栽培品种的耐寒性改良和种质资源选育提供新的基因资源，为推动葡萄产业提质增效和转型升级提供新的应用价值，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

技术特征：

1.一种葡萄蜡酯合成酶vvwsd1基因，其特征在于，所述葡萄蜡酯合成酶vvwsd1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码的蛋白质序列如seq id no.2所示，该基因包含1542bp的开放阅读框，编码514个氨基酸，所述vvwsd1基因受低温胁迫诱导，在植物抗低温胁迫中发挥作用。

2.根据权利要求1所述的一种葡萄蜡酯合成酶vvwsd1基因，其特征在于，所述vvwsd1的分子式组成为c4710h7877n1545o1970s323，预测的分子量为57.5kda，等电点为9.05，不稳定系数为39.26。

3.根据权利要求1或2所述的一种葡萄蜡酯合成酶vvwsd1基因，其特征在于，所述vvwsd1基因的扩增引物，正向引物如seq id no.3所示，反向引物如seq id no.4所示。

4.权利要求1-3任一项所述vvwsd1基因在植物抗寒中的应用。

5.根据权利要求4所述的vvwsd1基因在植物抗寒中的应用，其特征在于，将vvwsd1基因在植物中进行瞬时过表达，显著提高叶片中蜡脂、脂肪酸和烷烃类物质的积累；和/或

6.根据权利要求4所述的vvwsd1基因在植物抗寒中的应用，其特征在于，将vvwsd1基因在葡萄愈伤组织中进行过表达，低温胁迫时，过表达葡萄愈伤组织较野生型葡萄愈伤组织提高了生长率和脯氨酸含量；降低了mda含量、h2o2、和超氧阴离子积累量。

7.根据权利要求4所述的vvwsd1基因在植物抗寒中的应用，其特征在于，将vvwsd1基因在葡萄愈伤组织中进行过表达，低温胁迫时，显著提高冷相关基因vvcbf1、vvcbf2、vvcbf3、vvcor15a、vvkin2、vvrd29a的表达量。

8.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述植物为葡萄、拟南芥、或烟草。

9.权利要求1-3任一项所述vvwsd1基因在植物抗寒遗传改良中的应用。

10.根据权利要求9所述的vvwsd1基因在植物抗寒遗传改良中的应用，其特征在于，将vvwsd1基因在愈伤组织中过表达，愈伤组织诱导成苗；和/或将vvwsd1基因在植物体内过表达，繁殖筛选后代。

技术总结
本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种葡萄蜡酯合成酶VvWSD1及其在植物抗寒遗传改良中的应用，公开了基因VvWSD1对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.2所示。将该基因在葡萄愈伤组织中超表达后，获得的转基因葡萄愈伤组织抗寒性明显增加。而将该基因在拟南芥中超表达后，获得的转基因拟南芥表皮蜡质积累同时抗寒性明显增加，能够为葡萄栽培品种的耐寒性改良和种质资源选育提供新的基因资源。

技术研发人员：叶青,刘新,张雨柔,朱晓敏,田也,宗全颖,惠梦玲
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15