多重PCR鉴别石菖蒲和金钱蒲中药材及其水提物制剂的方法和应用与流程

本申请涉及中药鉴别，特别涉及一种多重pcr鉴别石菖蒲和金钱蒲中药材及其水提物制剂的方法和应用。

背景技术：

1、《中国药典》(2020年版)规定石菖蒲来源为天南星科植物石菖蒲acorustatarinowii schott的干燥根茎，秋、冬二季采挖，除去须根和泥沙，晒干，气芳香，味苦、微辛，主治开窍豁痰，醒神益智，化湿开胃，临床上用于健忘失眠、耳鸣耳聋、神昏癫痫、脘痞不饥、噤口下痢。金钱蒲为天南星科植物金钱蒲acorus gramineus soland，其中香叶菖蒲acorus xiangyeus、茴香菖蒲acorus macrospadiceus、acorus latifolius宽叶菖蒲是金钱蒲acorus gramineus的异名，植物智(植物智慧信息系统)上均以正名为金钱蒲acorusgramineus。金钱蒲根茎可入药，主治痰涎壅闭、神识不清、慢性气管炎、痢疾、肠炎等。《神农本草经》记载金钱蒲“主风寒湿痹，咳逆上气，开心孔，补五脏，通九窍，明耳目，出音声”。

2、石菖蒲和金钱蒲进化关系相近，但品种不同，两者的化学成分和功效都有差异，不可混用。由于两种药材的外观性状极为相似，传统鉴别方法受限于检验人员的专业知识和经验，难以辨认，另外加工成饮片后失去性状特征，对石菖蒲和金钱蒲的掺混样品难以进行准确鉴别，极大影响了石菖蒲的用药安全。

3、为保障中药用药安全与临床疗效，有必要开发一种准确度高、专属性好且检测效率高的石菖蒲和金钱蒲的鉴别方法。

技术实现思路

1、基于此，本申请的目的包括提供一种石菖蒲和金钱蒲中药材及其水提制剂的特异性鉴别方法、特异性鉴别引物对、试剂盒和应用，使用该特异性鉴别引物对样品dna进行扩增，所得扩增产物能用于石菖蒲和金钱蒲中药材及其水提制剂的鉴别。

2、本申请的目的可以通过以下技术方案实现：

3、本申请的一个方面，提供一种引物对，所述引物对包括第一引物对和/或第二引物对；

4、所述第一引物对包括：碱基序列如seq id no:1所示的正向引物以及碱基序列如seq idno:2所示的反向引物；

5、所述第二引物对包括：碱基序列如seq id no:3所示的正向引物以及碱基序列如seq id no:4所示的反向引物。

6、本申请的再一方面，提供上述技术方案所述的引物对在石菖蒲和金钱蒲中药材及其水提制剂的特异性鉴别中的应用。

7、本申请的再一方面，提供一种用于特异性鉴别石菖蒲和金钱蒲中药材及其水提制剂的试剂盒，其包含上述任一技术方案所述的引物对。

8、在一些实施方式中，所述的试剂盒还包括扩增试剂。

9、在一些实施方式中，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dntp和dna聚合酶中的一种或几种。

10、本申请的再一方面，提供一种石菖蒲和金钱蒲中药材及其水提制剂的多重pcr鉴别方法，包括以下步骤：

11、提取待测样品的dna；

12、采用上述任一技术方案所述的引物对或者试剂盒对所述待测样品的dna进行扩增，制备扩增产物；以及，

13、对所述扩增产物进行检测，根据所得检测结果实现对所述待测样品的鉴别。

14、在一些实施方式中，所述扩增的程序包括：将扩增的反应体系在94℃～96℃预变性4min～6min，再在预设程序下循环33～35次，再在71℃～73℃延伸4min～6min；

15、所述预设程序包括：在94℃～96℃下变性20s～40s，再在61℃～63℃退火20s～40s，再在71℃～73℃延伸20s～40s。

16、在一些实施方式中，每25μl的扩增的反应体系包括：2μl～3μl的10×pcr缓冲液、1.5μl～2.5μl的dntp、0.15μl～0.25μl的taq dna聚合酶、0.2μl～0.4μl的所述第一正向引物、0.2μl～0.4μl的所述第一反向引物、0.2μl～0.4μl的所述第二正向引物、0.2μl～0.4μl的所述第二反向引物和2μl～4μl的待测样品的dna。

17、在一些实施方式中，在所述扩增体系中：所述第一正向引物的浓度为0.2μmol/l～0.4μmol/l、所述第一反向引物的浓度为0.2μmol/l～0.4μmol/l、所述第二正向引物的浓度为0.2μmol/l～0.4μmol/l、所述第二反向引物的浓度为0.2μmol/l～0.4μmol/l。

18、在一些实施方式中，所述的多重pcr鉴别方法中，对所述扩增产物进行检测，根据所得检测结果实现对所述待测样品的鉴别，包括：

19、采用琼脂糖凝胶电泳法对所述扩增产物进行检测，根据所得电泳图中344bp或/和321bp处是否出现条带，确定所述待测样品中是否含有石菖蒲或/和金钱蒲。

20、本申请提供了一种引物对，其包括第一引物对和/或第二引物对；第一引物对包括：碱基序列如seq id no:1所示的正向引物以及碱基序列如seq id no:2所示的反向引物；第二引物对包括：碱基序列如seq id no:3所示的正向引物以及碱基序列如seq id no:4所示的反向引物。采用该引物对对金钱蒲和石菖蒲中药材及其水提制剂dna进行扩增，所得扩增产物能用于鉴别金钱蒲和石菖蒲中药材及其水提制剂的物种，以及其真伪或掺伪情况，可以解决水提取物(含中药配方颗粒)在失去形态后难以鉴别的难题。

21、本申请的鉴别方法专属性好、结果准确度高，为金钱蒲和石菖蒲中药材及其水提制剂的用药安全和临床疗效提供保障。

技术特征：

1.一种引物对，其特征在于，所述引物对包括第一引物对和/或第二引物对；

2.权利要求1所述的引物对在石菖蒲和金钱蒲中药材及其水提制剂的特异性鉴别中的应用。

3.一种用于特异性鉴别石菖蒲和金钱蒲中药材及其水提制剂的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的引物对。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括扩增试剂。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dntp和dna聚合酶中的一种或几种。

6.一种石菖蒲和金钱蒲中药材及其水提制剂的多重pcr鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的多重pcr鉴别方法，其特征在于，所述扩增的程序包括：将扩增的反应体系在94℃～96℃预变性4min～6min，再在预设程序下循环33～35次，再在71℃～73℃延伸4min～6min；

8.如权利要求6所述的多重pcr鉴别方法，其特征在于，每25μl的扩增的反应体系包括：2μl～3μl的10×pcr缓冲液、1.5μl～2.5μl的dntp、0.15μl～0.25μl的taq dna聚合酶、0.2μl～0.4μl的所述第一正向引物、0.2μl～0.4μl的所述第一反向引物、0.2μl～0.4μl的所述第二正向引物、0.2μl～0.4μl的所述第二反向引物和2μl～4μl的待测样品的dna。

9.如权利要求8所述的多重pcr鉴别方法，其特征在于，在所述扩增体系中：所述第一正向引物的浓度为0.2μmol/l～0.4μmol/l、所述第一反向引物的浓度为0.2μmol/l～0.4μmol/l、所述第二正向引物的浓度为0.2μmol/l～0.4μmol/l、所述第二反向引物的浓度为0.2μmol/l～0.4μmol/l。

10.如权利要求6～9中任一项所述的多重pcr鉴别方法，其特征在于，对所述扩增产物进行检测，根据所得检测结果实现对所述待测样品的鉴别，包括：

技术总结
本申请涉及中药鉴别技术领域，特别涉及一种引物对、试剂盒、其在石菖蒲和金钱蒲中药材、中药配方颗粒和其他水提物制剂的特异性鉴别中的应用和鉴别方法。本申请的引物对包括第一引物对，其包括正向引物SEQ ID NO:1以及反向引物SEQ ID NO:2，和第二引物对，其包括正向引物SEQ ID NO:3以及反向引物SEQ ID NO:4，采用引物对进行扩增，所得产物能用于鉴别金钱蒲和石菖蒲中药材及其水提制剂的物种、真伪及掺伪情况。本申请的多重PCR鉴别方法专属性好、结果准确度高，可解决水提取物在失去形态后难以鉴别的难题，为石菖蒲和金钱蒲用药安全和临床疗效提供保障。

技术研发人员：谭斯尹,宋叶,兰小勇,潘礼业,钟春琳,陈向东,孙冬梅,沈斌斌,张军,李国卫,罗宇琴
受保护的技术使用者：广东一方制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/3/3