柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株及其构建方法和应用

本发明是关于基因工程，特别是关于一种柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、鸡球虫病是一种以肠道病变为主的寄生原虫病，是集约化养鸡场最常见的疾病之一，呈世界性分布，鸡球虫病的发病率高达50-70％，死亡率为20-30％，严重时高达80％，给养鸡业带来巨大经济损失，美国农业部将该病列为对禽类危害最严重的五大疾病之一。世界公认的鸡球虫有7种，其中寄生于盲肠中的柔嫩艾美耳球虫(eimeria tenella)致病性最强，危害最严重。

2、目前，球虫病的防控主要是依靠抗球虫药物和活疫苗，但由于球虫耐药性、药物残留和环境毒性等问题，抗球虫药物的使用受到了很大限制。鸡球虫病活毒疫苗常指由分离虫株制作的活毒苗，国内外已有数个产品注册使用，免疫保护力较强，但由于疫苗虫株即为分离毒株，存在一定的安全隐患，这使得市场上可用的球虫病疫苗十分有限。近年来，随着基因编辑技术的成熟，构建具有良好免疫原性和免疫保护力的弱毒基因缺失疫苗成为突破各类防控难题的新方向，但由于球虫缺少良好的基因编辑手段，导致在球虫基因缺失疫苗的研究还处于空白。

3、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株及其构建方法和应用，其能够解决柔嫩艾美耳球虫的疫苗虫株为分离毒株因而存在安全隐患的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株，缺失柔嫩艾美耳球虫的菱形蛋白1基因，所述菱形蛋白1基因的核苷酸序列为seq id no：1。

3、本发明还提供一种如上述的柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的构建方法，应用crispr/cas9方法，包括以下步骤：

4、s1、构建rom1-grna-ko质粒：扩增骨架载体序列、5’mic2-dhfr-mcherry-3’actin-u6promoter序列和rom1grna-scaffold序列，扩增rom1 grna-scaffold序列时，通过在引物中加入针对菱形蛋白1基因敲除的grna序列而引入特异性grna，将上述序列进行连接；

5、s2、构建柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株，具体包括：

6、(1)提取ethcya虫株子孢子；

7、(2)转染步骤(1)提取的ethcya虫株子孢子，转染体系包括ethcya虫株子孢子、核转bufferⅰ、核转bufferⅱ、限制性内切酶、线性化rom1-grna-ko质粒，将转染得到的子孢子接种入侵鸡类，收集卵囊，得到yfp+mcherry+阳性卵囊，得到柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株。

8、进一步的，步骤s1中，序列连接过程中，设计的引物序列为：

9、骨架载体序列的引物

10、1-f(seq id no：2)：atggctttcttgccgccaag；

11、1-r(seq id no：3)：gcgctgtgtgcatatgtcga；

12、5’mic2-dhfr-mcherry-3’actin-u6 promoter序列的引物

13、2-f(seq id no：4)：tcgacatatgcacacagcgc；

14、2-r(seq id no：5)：aacctgaagtgccgtcttcg；

15、rom1 grna-scaffold序列的引物

16、3-f(seq id no：6)：

17、cgaagacggcacttcaggttatgagcagcgcaacagagatggttttagagctag aaatag；

18、3-r(seq id no：7)：gccatcagatccttggcggcaagaaagccat。

19、进一步的，步骤s1还包括：rom1-grna-ko质粒的扩增和线性化。

20、优选的，步骤s2的(1)中，使用percoll法提取ethcya虫株子孢子。

21、进一步的，步骤s2还包括

22、(3)柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的筛选，按percoll法提取转染后的子孢子，流式分选带有yfp+mcherry+的阳性孢子囊为柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株，将所述阳性孢子囊接种入侵1周龄的鸡类，收集卵囊，percoll法提取卵囊的孢子囊，流式分选带有yfp+mcherry+的单个阳性孢子囊，接种入侵3日龄的鸡类，收集卵囊并且孢子化，选取荧光显微镜下发光率达到100％的单克隆阳性的柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株。

23、进一步的，还包括

24、s3、柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的鉴定，提取柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的dna，pcr鉴定，鉴定grna引物如下：

25、4-f(seq id no：8)：gatcagttcgcgtccaaacg；

26、4-r(seq id no：9)：cgactcggtgccacttttca；

27、鉴定rom1基因缺失引物如下：

28、5-f(seq id no：10)：ctctccaatccctcaaagcgt；

29、5-r(seq id no：11)：aaaaggaaggcacccagcat。

30、本发明还提供一种柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的应用，用于研制鸡的柔嫩艾美耳球虫病基因缺失弱毒疫苗。

31、与现有技术相比，根据本发明的柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株及其构建方法和应用，具有如下有益效果：

32、柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株(δrom1)，缺失柔嫩艾美耳球虫的菱形蛋白1基因(rom1基因)，致病性显著降低，具有良好的免疫保护效果，接种鸡后能够有效抵抗柔嫩艾美耳球虫的再感染，能够用于研制鸡的柔嫩艾美耳球虫病基因缺失弱毒疫苗。

技术特征：

1.一种柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株，其特征在于，缺失柔嫩艾美耳球虫的菱形蛋白1基因，所述菱形蛋白1基因的核苷酸序列为seq id no：1。

2.一种如权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的构建方法，其特征在于，应用crispr/cas9方法，包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的构建方法，其特征在于，步骤s1中，序列连接过程中，设计的引物序列为：

4.如权利要求2所述的柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的构建方法，其特征在于，步骤s1还包括：rom1-grna-ko质粒的扩增和线性化。

5.如权利要求2所述的柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的构建方法，其特征在于，步骤s2的(1)中，使用percoll法提取ethcya虫株子孢子。

6.如权利要求2所述的柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的构建方法，其特征在于，步骤s2还包括

7.如权利要求2所述的柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的构建方法，其特征在于，还包括

8.如权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株的应用，其特征在于，用于研制鸡的柔嫩艾美耳球虫病基因缺失弱毒疫苗。

技术总结
本发明公开了柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株及其构建方法和应用。柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株，缺失柔嫩艾美耳球虫的菱形蛋白1基因，所述菱形蛋白1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，应用CRISPR/Cas9方法进行构建。柔嫩艾美耳球虫rom1基因缺失弱毒虫株(Δrom1)，致病性显著降低，具有良好的免疫保护效果，接种鸡后能够有效抵抗柔嫩艾美耳球虫的再感染，能够用于研制鸡的柔嫩艾美耳球虫病基因缺失弱毒疫苗。

技术研发人员：胡丹丹,汤新明,杜诗琪,宋星桔,樊景志
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15