骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法与流程

本申请涉及生物组织工程，例如涉及一种骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法。

背景技术：

1、骨肉瘤（osteosarcoma），是一种恶性骨肿瘤，特点是肿瘤细胞可直接产生骨样组织。骨肉瘤好发于青少年，好发部位为股骨远端、胫骨近端和肱骨近端的干骺端。然而，目前骨肉瘤的发病机制并不明确。

2、在体外构建的骨肉瘤类器官是研究骨肉瘤的优势模型，便于对其进行研究分析，对发病机制的研究能够起到积极作用。3d培养近年来被广泛应用，相较于传统2d培养更具有优势，为细胞提供更生理的环境。3d培养体系为细胞提供类似体内生长环境的基质，细胞通过与胞外基质间的联系形成一定的三维结构，与体内细胞生长情况更为相似。

3、在实现本公开实施例的过程中，发现相关技术中至少存在如下问题：3d培养过程中所采用的培养液是构建3d类器官的关键因素，目前针对骨肉瘤类器官培养用的培养液种类少，且培养效果有限。

技术实现思路

1、为了对披露的实施例的一些方面有基本的理解，下面给出了简单的概括。所述概括不是泛泛评述，也不是要确定关键／重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围，而是作为后面的详细说明的序言。

2、本公开实施例提供一种骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法，以提高骨肉瘤类器官的培养成功率。

3、在一些实施例中，所述骨肉瘤类器官培养液，包括原代培养液和传代培养液；其中，原代培养液包括条件培养基、基础培养基和复合生长因子，所述复合生长因子包括human egf 40～100 ng/ml，hepes 10～15 mm，glutamax 1x，n2 1x，b27 1x，n-acetylcysteine1～2 mm，青霉素-链霉素 1.5x～2x，primocin 0.2～2 mg/ml，niacinamide10 mm，gastrin10～20 nm，prostaglandin e2 1 μm，y-27632 5～15 μm，a83-01 100～500 nm，sb202190 10～20 nm和胎牛血清2%～15%；所述条件培养基为r-spondin1条件培养基，r-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%；传代培养液是在原代培养液的基础上，复合生长因子还包括fgf 60～150 ng/ml，且青霉素-链霉素的含量为0.5x～1x；所述条件培养基还包括辅助蛋白条件培养基且所述辅助蛋白条件培养基包括wnt-3a条件培养基和/或noggin条件培养基，其中，r-spondin1条件培养基与辅助蛋白培养基的体积比为1﹕0.5～2，r-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%。

4、在一些实施例中，所述骨肉瘤类器官培养试剂组合，包括：酶解液和前述的骨肉瘤类器官培养液；以及，第一完全培养基和第二完全培养基；所述酶解液包括基础培养基、ⅳ型胶原酶、ⅱ型胶原酶和primocin；其中，ⅳ型胶原酶和ⅱ型胶原酶的总浓度为1～2 mg/ml，且ⅳ型胶原酶和ⅱ型胶原酶的质量比为1﹕1.5～2.5；primocin的浓度为0.2～2 mg/ml。

5、在一些实施例中，所述骨肉瘤类器官的培养方法，包括：将骨肉瘤样本进行物理预处理，得到2～4 mm的样本组织碎块；将样本组织碎块转移至离心管中，采用前述的骨肉瘤类器官培养试剂组合中的酶解液进行摇床孵育，孵育30～60min；孵育完成后，将酶解混合液过滤得滤过液，将所述滤过液离心处理，获得细胞沉淀；采用基质胶重悬所述细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后将所述凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养，使得所述凝胶凝固；向培养孔内加入前述的骨肉瘤类器官培养液的原代培养液进行培养，获得原代骨肉瘤类器官；将所述原代骨肉瘤类器官进行传代培养，所述传代培养过程中采用前述的骨肉瘤类器官培养液的传代培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为10～15天，获得相应代骨肉瘤类器官。

6、本公开实施例提供的一种骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法，可以实现以下技术效果：

7、本公开实施例提供的骨肉瘤类器官培养液分为原代培养液和传代培养液，根据骨肉瘤类器官的特性，在传代培养液中，以条件培养基和基础培养基的混合液作为载体，其中条件培养基包括r-spondin1条件培养基和辅助蛋白培养基，且辅助蛋白条件培养基包括wnt-3a条件培养基和/或noggin条件培养基，通过调控r-spondin1条件培养基、辅助蛋白培养基和基础培养基的比例，获得混合液，并在混合液中分散多种生长因子及各因子的用量，rspodin1为关键因子，可以激活增殖干细胞的wnt/β-连环蛋白信号通路，保证3d类器官的干性维持、增殖生长；进一步地协同sb202190、fgf和胎牛血清等，尤其是与fgf和胎牛血清的协同作用，在类器官形成后，维持肿瘤细胞的增殖、代谢活性和分化，保持类器官的病理特征。即，在传代培养过程中，传代培养液中各组分及其用量相互协同，配合青霉素-链霉素的浓度，促进了骨肉瘤类器官细胞的形成和生长，保证培养的成功率；且使得传代培养过程中能够维持病理特征，保证其完整性，以及增殖速度。同时，在传代培养过程中，培养10～15天即可达到传代要求。

8、而在原代培养过程中，在原代培养液中减去了fgf，提高了青霉素-链霉素的浓度，并在保证rspodin1条件培养基在混合液中的比例不变的前提下减去了辅助蛋白条件培养基，从而有利于在原代培养中纯化出骨肉瘤肿瘤细胞，减少其他组织细胞的干扰生长。

9、本公开实施例提供的骨肉瘤类器官培养试剂组合中，酶解液利用ⅳ型胶原酶和ⅱ型胶原酶进行联合酶解，能够对骨肉瘤样本进行有效酶解，获得的细胞活性高，同时配合primocin的浓度控制，可有效降低样本污染；然后利用本公开实施例的骨肉瘤类器官培养液对骨肉瘤肿瘤样本进行培养，能够加快骨肉瘤类器官细胞的生长，提高培养速度。

10、本公开实施例提供的骨肉瘤类器官的培养方法，操作简单，采用本公开实施例的骨肉瘤类器官培养液的原代培养液能够有效缩减原代类器官形成与生长时间，且更有利于纯化出骨肉瘤肿瘤细胞。在传代培养时，采用传代培养液，每代培养时间为10～15天。在传代培养过程中，培养3天类器官直径可达50～80 μm，10天可达200μm，传代周期稳定。而且，在采用骨肉瘤类器官培养试剂组合进行原代提取培养过程中，培养3～4天类器官直径即可达50～100 μm，培养10天后即可见大量骨肉瘤类器官形成，最大直径达200 μm以上，原代培养7～10天的骨肉瘤类器官即可进行传代。

11、以上的总体描述和下文中的描述仅是示例性和解释性的，不用于限制本申请。

技术特征：

1.一种骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，包括原代培养液和传代培养液；其中，原代培养液包括条件培养基、基础培养基和复合生长因子，所述复合生长因子包括human egf40～100 ng/ml，hepes 10～15 mm，glutamax 1x，n2 1x，b27 1x，n-acetylcysteine1～2mm，青霉素-链霉素 1.5x～2x，primocin 0.2～2 mg/ml，niacinamide10 mm，gastrin10～20 nm，prostaglandin e2 1 μm，y-27632 5～15 μm， a83-01 100～500 nm，sb202190 10～20 nm和胎牛血清2%～15%；所述条件培养基为r-spondin1条件培养基，r-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%；

2.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，在传代培养液中，复合生长因子包括human egf 80 ng/ml，hepes 12 mm，glutamax 1x，n2 1x，b27 1x，n-acetylcysteine 1.5 mm，青霉素-链霉素 1x，primocin 1 mg/ml，niacinamide10 mm，gastrin15 nm，prostaglandin e2 1 μm，y-27632 10 μm，a83-01 300 nm，sb202190 15nm、胎牛血清10%和fgf 100 ng/ml。

3.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，

4.根据权利要求3所述的骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，

5.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，辅助蛋白培养基包括wnt-3a条件培养基和noggin条件培养基，且wnt-3a条件培养基和noggin条件培养基的体积比为1:0.8～1.2。

6.根据权利要求1至5任一项所述的骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，r-spondin1条件培养基、wnt-3a条件培养基和noggin条件培养基，各自通过初次培养和传代培养后，再进行收取培养获得；

7.一种骨肉瘤类器官培养试剂组合，其特征在于，包括：酶解液和如权利要求1至6任一项所述的骨肉瘤类器官培养液；以及，权利要求6的骨肉瘤类器官培养液中的第一完全培养基和第二完全培养基；所述酶解液包括基础培养基、ⅳ型胶原酶、ⅱ型胶原酶和primocin；其中，ⅳ型胶原酶和ⅱ型胶原酶的总浓度为1～2 mg/ml，且ⅳ型胶原酶和ⅱ型胶原酶的质量比为1﹕1.5～2.5；primocin的浓度为0.2～2 mg/ml。

8.根据权利要求7所述的骨肉瘤类器官培养试剂组合，其特征在于，所述酶解液包括基础培养基、ⅳ型胶原酶、ⅱ型胶原酶和primocin；其中，ⅳ型胶原酶和ⅱ型胶原酶的总浓度为1.5 mg/ml，且ⅳ型胶原酶和ⅱ型胶原酶的质量比为1﹕2；primocin的浓度为1 mg/ml。

9.一种骨肉瘤类器官的培养方法，其特征在于，包括：

10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述物理预处理，包括：

技术总结
本申请涉及生物组织工程技术领域，公开一种骨肉瘤类器官培养液，包括原代培养液和传代培养液，原代培养液和传代培养液均包括条件培养基、基础培养基、复合抗生素和生长因子。根据骨肉瘤类器官的特性，在原代培养液中减去了辅助蛋白条件培养基和表皮生长因子，且提高了青霉素‑链霉素的浓度，从而更有利于在原代培养中抑制原代组织的污染风险并能够纯化出骨肉瘤肿瘤细胞；以及，优化的传代培养液能够维持骨肉瘤病理特征，保证增殖速度。适用于人源骨肉瘤类器官的培养。本申请还公开一种培养试剂组合及培养方法。

技术研发人员：肖荣荣,刘建闯,程曦,向康禄,周宇
受保护的技术使用者：北京大橡科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15