本发明属于分子生物学,涉及核酸适配体,尤其涉及一种特异性结合prl蛋白的核酸适配体及应用、试剂盒。
背景技术:
1、催乳素(prl)是一种在中枢神经系统(cns)中具有多种作用的激素,从生理学到病理。prl通过其受体发挥不同的作用,这些受体可以在大脑的神经元和神经胶质细胞(星形胶质细胞,小胶质细胞和少突胶质细胞)中找到。一般认为,在脊椎动物中,催乳素(prl)主要由垂体泌乳素合成和释放,并通过激活prl受体(prlr)在许多生理过程中发挥重要作用,包括水和电解质平衡,繁殖,生长发育,代谢,免疫调节和行为。
2、泌乳素是一种多肽激素,也叫催乳素(prl),是脑垂体所分泌的激素中的一种。妇女在怀孕后期及哺乳期,泌乳素分泌旺盛,以促进乳腺发育与泌乳。非孕妇女血清中泌乳素水平最高值一般不会超过20纳克/毫升.泌乳素的分泌是脉冲式的,一天之中就有很大的变化。睡眠1小时内泌乳素分泌的脉冲幅度迅速提高,之后在睡眠中分泌量维持在较高的水平,醒后则开始下降。清晨3、4点钟时血清的泌乳素分泌浓度是中午的一倍。生理性增高:常见于新生儿期、妊娠、月经、应激状态、吸吮、产后、泌乳期、夜间睡眠等。某些药物也可引起高泌乳血症,如冬眠灵、酚噻嗪、利血平、口服避孕药、雌激素治疗及抗组织胺类药物等。病理性增高:常见于垂体性肿瘤、下丘脑紊乱、肿瘤、肉瘤、脑膜炎、chiari-frommel综合征、nelson综合征、闭经、乳溢综合征。慢性肾功能不全、甲状腺功能低下、肾上腺功能低下,也可引起prl升高。
3、因此,催乳素的检测在临床具有非常重要的意义。目前临床检测催乳素主要运用化学发光免疫分析法、免疫放射分析法等,成本较高。
4、核酸适配体是一小段经体外筛选获得的寡核苷酸序列或者短的多肽,可以和相对应的靶标进行高亲和力和强特异性的结合,可以经过体外筛选技术——指数富集的配体进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,selex)获得,可经过人工合成。近年来,适配体是广泛用于治疗和检测的一种新型合成分子,与抗体相比具有成本低、可化学合成、无批间差、耐热、易于修饰等优势。在疾病诊断和治疗方面具有巨大潜力,近年来取得了巨大进展。目前未见利用核酸适配体进行prl水平检测的相关报导,现有监测方法主要缺陷在于:灵敏度低、成本高、检测时间长、存在批间差。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足,本发明的目的是提供一种特异性结合prl蛋白的核酸适配体及应用、试剂盒,本发明筛选获得高亲和力,高特异性,分子量低易于修饰的prl蛋白核酸适配体,取代抗体。
2、为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
3、本发明首先提供了一种特异性结合prl蛋白的核酸适配体,包括seq id no.1与seq idno.2所示的核苷酸序列;或者,与seq id no.1及seq id no.2核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合prl蛋白的核苷酸序列;或者由seq id no.1及seq id no.2所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合prl蛋白的核苷酸序列。
4、作为本发明的一种优选方案,所述具有高同源性是指与seq id no.1及seq idno.2所示的核苷酸序列至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的同源性。
5、作为本发明的一种优选方案,所述核酸适配体包含与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列并且保持亲和力。
6、作为本发明的一种优选方案,所述核酸适配体的核苷酸序列包含碱基修饰并且保持亲和力。
7、作为本发明的一种优选方案,所述碱基修饰为硫代修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、氨基化修饰、巯基化修饰、硒取代氧修饰或连接同位素修饰。
8、本领域技术人员应该理解,作为对上述技术方案的改进,可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰,例如,磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或连接同位素化等,条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质,例如,可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合prl蛋白的亲和力,或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
9、作为本发明的一种优选方案,所述核酸适配体的核苷酸序列包含标记物并且保持亲和力。
10、作为本发明的一种优选方案,所述标记物为荧光标记物,放射性标记物、治疗性标记物、生物素标记物、地高辛标记物、纳米发光材料标记物、小肽标记物、sirna标记物或酶标记物。
11、本领域技术人员应该理解,作为对上述技术方案的改进,可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质,放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna或酶标记等,条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质,例如,可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合prl蛋白的亲和力,或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
12、换言之,以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体序列,都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能,都可应用于与prl蛋白的结合。
13、本发明还提供了利用上述的特异性结合prl蛋白的核酸适配体检测prl含量上的应用。
14、本发明还提供了利用适配体双抗夹心检测prl含量的试剂盒,包括上述的特异性结合prl蛋白的核酸适配体。
15、与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
16、1)核酸适配体与抗体相比分子量小,稳定性更好,易改造修饰,无免疫原性,制作周期短,可以通过人工合成等优势,免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程,因此核酸适配体是一种非常理想的分子探针。针对于prl蛋白的核酸适配体还没有人公布且没有人应用该适配体,因此,本领域对针对prl蛋白有高结合亲和力的核酸适配体存在需求。
17、2)核酸适配体相较于抗体,更稳定,由于是化学合成,批间差异几乎没有;并将该核酸适配体成功用于prl蛋白的检测。
18、3)本发明提供了一种高亲和力,高特异性,分子量低易于修饰且有望替代抗体的能够结合prl蛋白的核酸适配体,还相应提供所述核酸适配体的筛选方法与应用。
1.一种特异性结合prl蛋白的核酸适配体,其特征在于,包括seq id no.1与seq idno.2所示的核苷酸序列;或者,与seq id no.1及seq id no.2核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合prl蛋白的核苷酸序列;或者由seq id no.1及seq id no.2所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合prl蛋白的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种特异性结合prl蛋白的核酸适配体,其特征在于,所述具有高同源性是指与seq id no.1及seq id no.2所示的核苷酸序列至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的同源性。
3.根据权利要求1所述的一种特异性结合prl蛋白的核酸适配体,其特征在于,所述核酸适配体包含与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列并且保持亲和力。
4.根据权利要求1所述的一种特异性结合prl蛋白的核酸适配体,其特征在于,所述核酸适配体的核苷酸序列包含碱基修饰并且保持亲和力。
5.根据权利要求4所述的一种特异性结合prl蛋白的核酸适配体,其特征在于,所述碱基修饰为硫代修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、氨基化修饰、巯基化修饰、硒取代氧修饰或连接同位素修饰。
6.根据权利要求1所述的一种特异性结合prl蛋白的核酸适配体,其特征在于,所述核酸适配体的核苷酸序列包含标记物并且保持亲和力。
7.根据权利要求6所述的一种特异性结合prl蛋白的核酸适配体,其特征在于,所述标记物为荧光标记物,放射性标记物、治疗性标记物、生物素标记物、地高辛标记物、纳米发光材料标记物、小肽标记物、sirna标记物或酶标记物。
8.特异性结合prl蛋白的核酸适配体的应用,其特征在于,利用权利要求1-7任一项所述的特异性结合prl蛋白的核酸适配体检测prl含量。
9.利用适配体双抗夹心检测prl含量的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1-7任一项所述的特异性结合prl蛋白的核酸适配体。