一种与犬毛型相关的SNP分子标记检测体系及其应用

本发明涉及生物，特别涉及一种与犬毛型相关的snp分子标记检测体系，以及该检测体系的应用。

背景技术：

1、犬毛型是犬的基本特征之一，属质量性状，其表型差异(被毛长短、卷曲与否、胡须与眉毛等)主要与3个基因的变异有关，分别为成纤维细胞生长因子5(fgf5)与犬长毛发有关；角蛋白71(krt71)与卷曲程度相关；r-自旋蛋白2基因(rspo2)与长发有关与毛皮的质地和生长模式有关。

2、目前针对犬毛型基因的研究多基于基因组测序，通过遗传学研究找到染色体上的变异位点；这种方法需要借助高通量测序平台，依赖强大的数据支撑和专业的数据挖掘及生物信息学背景，分析过程复杂且成本高昂。因此，需要建立一种简单、快速、结果易判读的常规检侧方法来实现犬毛型基因检测的通用和推广。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种与犬毛型相关的snp分子标记检测体系，以及该检测体系的应用，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。

2、本发明第一方面提供了一种与犬毛型相关的snp分子标记检测体系。所述检测体系用于检测以下至少一个snp分子标记：

3、krt71基因的c.451c>t位点、c.1266_1273delinsaca位点；

4、fgf5基因的c.284g>t位点、g.4517257t>a位点、c.578c>t位点、c.556_571del位点、c.559_560dup位点；

5、rspo2基因的167ins位点。

6、所述krt71基因位于27号染色体，与犬只的犬毛卷曲性状相关；所述fgf5基因位于32号染色体，与犬只的犬长毛性状相关；。所述rspo2基因位于13号染色体，与犬只的犬杂形毛或胡须性状相关；所述167ins位点是指rspo2基因3'utr的167bp插入突变位点。

7、在本发明的一些应用实施方式中，所述检测体系同管复合扩增的snp分子标记包括krt71基因的c.451c>t位点、c.1266_1273delinsaca位点，fgf5基因的c.284g>t位点、g.4517257t>a位点、c.556_571del位点、c.578c>t位点、c.559_560dup位点和rspo2基因的167ins位点。所述检测体系能够同时检测与犬毛型相关的4个snp位点与4个插入缺失位点实现犬毛型相关联snp分子标记位点的的基因型，从而用于犬毛型鉴定、繁育选择和美容护理等提供指导建议。

8、在本发明的一些应用实施方式中，基于一代测序平台使用8组引物组合同管扩增8个犬毛型相关的snp分子标记，包括特异性扩增所述c.451c>t位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.1～3所示，特异性扩增所述c.1266_1273delinsaca位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.4～5所示，特异性扩增所述c.284g>t位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.6～8所示，特异性扩增所述g.4517257t>a位点的引物组合的核苷酸序列如seqid no.9～11所示，特异性扩增所述c.556_571del位点的引物组合的核苷酸序列如seq idno.12～13所示，特异性扩增所述c.578c>t位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.14～16所示，特异性扩增所述c.559_560dup位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.17～18所示，特异性扩增所述167ins位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.19～20所示。

9、在本发明的一些应用实施方式中，各引物组合分为2个群组，第一群组包括核苷酸序列如seq id no.1～3、6～11、14～16所示的引物组合，第二群组包括核苷酸序列如seqid no.4～5、12～13、17～20所示的引物组合，各所述引物组合中均具有至少一条标记有荧光染料的引物，同一群组使用相同的荧光染料标记，各群组的荧光染料标记不相同。

10、在本发明的一些应用实施方式中，所述荧光染料选自fam、hex、tamra、sum或vig。

11、在本发明的一些应用实施方式中，所述第一群组的荧光染料为fam；所述第二组群组的荧光染料为hex。

12、在本发明的一些应用实施方式中，包括含dna聚合酶的pcr reaction mix和sdh2o。

13、具体的反应体系包括：引物组的混合物2.0μl，pcr master mix 4.0μl，sdh2o 3.0μl，加上1.0μl的待测dna模板(浓度0.1ng/μl)。扩增程序为：95℃预变性，持续2min；94℃变性，持续30s，58℃退火，持续1min，72℃延伸，持续50s，共30个循环；72℃延伸，持续10min。

14、本发明第二方面提供了所述检测体系在进行犬只毛发长短、卷曲程度、质地和生长模式性状分析中的应用。

15、在本发明的一些应用实施方式中，所述应用包括以下步骤：

16、1)提取dna样品；

17、2)使用分光光度计对所述dna样品进行定量，采用超纯水调节浓度为0.1ng/μl，4℃冰箱保存；

18、3)使用本发明第一方面提供的检测体系对调节浓度后的dna样品进行扩增；

19、4)取1μl扩增产物与0.3μl的内标siz加入到10μl的甲酰胺中，95℃变性3min后，冰浴3min，然后使用遗传分析仪进行毛细管电泳检测，使用分析软件对检测结果进行分析。

20、基于上述技术方案，本发明具有以下优点：

21、1、本发明涵盖目前研究发现的三种与犬毛型相关的主要基因fgf5、krt71和rspo2，可同时、高效地识别上述基因的8个突变位点。通过对这些突变位点的检测，可以同时预测犬的毛发长短、卷曲程度、质地和生长模式等性状。

22、2、本发明检测3种犬毛型基因的多重荧光pcr反应是在同一管内进行的，具有准确性高、特异性强等优势，此外，整个检测过程可在2～3小时内完成，能够满足样品快速检验要求。

23、3、本发明采用毛细管电泳检测方法，检测分辨率可达到1bp，对于目的片段长度差能够进行明显有效的区分。

24、4、本发明不仅弥补国内就犬毛型基因快速检测产品的空白，而且能够为犬毛型鉴定和繁育选择提供借鉴意义。

技术特征：

1.一种与犬毛型相关的snp分子标记检测体系，其特征在于，所述检测体系用于检测以下至少一个snp分子标记：

2.根据权利要求1所述检测体系，其特征在于，所述检测体系同管复合扩增的snp分子标记包括krt71基因的c.451c>t位点、c.1266_1273delinsaca位点，fgf5基因的c.284g>t位点、g.4517257t>a位点、c.556_571del位点、c.578c>t位点、c.559_560dup位点和rspo2基因的167ins位点。

3.根据权利要求2所述检测体系，其特征在于，包括特异性扩增所述c.451c>t位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.1～3所示，特异性扩增所述c.1266_1273delinsaca位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.4～5所示，特异性扩增所述c.284g>t位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.6～8所示，特异性扩增所述g.4517257t>a位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.9～11所示，特异性扩增所述c.556_571del位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.12～13所示，特异性扩增所述c.578c>t位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.14～16所示，特异性扩增所述c.559_560dup位点的引物组合的核苷酸序列如seq id no.17～18所示，特异性扩增所述167ins位点的引物组合的核苷酸序列如seq idno.19～20所示。

4.根据权利要求3所述检测体系，其特征在于，各引物组合分为2个群组，第一群组包括核苷酸序列如seq id no.1～3、6～11、14～16所示的引物组合，第二群组包括核苷酸序列如seq id no.4～5、12～13、17～20所示的引物组合，各所述引物组合中均具有至少一条标记有荧光染料的引物，同一群组使用相同的荧光染料标记，各群组的荧光染料标记不相同。

5.根据权利要求4所述检测体系，其特征在于，所述荧光染料选自fam、hex、tamra、sum或vig。

6.根据权利要求4所述检测体系，其特征在于，所述第一群组的荧光染料为fam；所述第二组群组的荧光染料为hex。

7.根据权利要求1至6任一项所述检测体系，其特征在于，包括含dna聚合酶的pcrreaction mix和sdh2o。

8.根据权利要求7所述检测体系，其特征在于，扩增程序为：95℃预变性，持续2min；94℃变性，持续30s，58℃退火，持续1min，72℃延伸，持续50s，共30个循环；72℃延伸，持续10min。

9.权利要求1至8任一项所述检测体系在进行犬只毛发长短、卷曲程度、质地和生长模式性状分析中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种与犬毛型相关的SNP分子标记检测体系及其应用。所述检测体系基于一代测序平台，涵盖目前研究发现的三种与犬毛型相关的主要基因FGF5、KRT71和RSPO2，可同时、高效地识别上述基因的8个突变位点。通过对这些突变位点的检测，可以同时预测犬的毛发长短、卷曲程度、质地和生长模式等性状。所述检测体系是在同一管内进行的多重荧光PCR反应，不易污染，且具有准确性高、特异性强等优势。整个检测过程可在2～3小时内完成，能够满足样品快速检验要求。本发明不仅弥补国内就犬毛型基因快速检测产品的空白，而且能够为犬毛型鉴定和繁育选择提供借鉴意义。

技术研发人员：杨前勇,请求不公布姓名,请求不公布姓名,李阳枫,江哲立,曾字,王思宇
受保护的技术使用者：九江学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16