一种丁酸梭菌的简易培养方法与流程

本发明属于微生物培养基及制备工艺，具体涉及一种丁酸梭菌的简易培养方法。

背景技术：

1、丁酸梭菌(clostridium butyricum)是一种梭菌属的厌氧芽孢杆菌，革兰氏阳性，老培养物变成阴性，约0.6-1.2×3.0-7.0μm，周生鞭毛，具运动性，菌体呈直或弯的杆菌，以单、双、短链形态存在，并偶见长丝状，在琼脂平板上形成白色或奶油色的不规则圆形菌落，稍突，表面湿润光滑，不透明，略有酸臭味，常发现于土壤、干酪、自然酸奶动物粪便中，发酵产物包括丁酸、醋酸、和丁醇。

2、大量研究表明，丁酸梭菌具有耐高温、耐酸、耐胆盐的生物学特性，能较好的进行动物肠道而不被胃酸破坏，并于肠道内定植，有效平衡肠道微生态失调，修复肠道炎症。丁酸梭菌作为添加剂添加至饲料中，还可减少抗生素的用量，提高动物的免疫力和饲料转化率，降低养殖成本，提高经济效益。

3、丁酸梭菌是一种严格厌氧菌，在培养过程中需要使用多种方法进行驱氧，例如采用充氮驱氧、生物除氧、添加还原剂等方式；现有技术中的各种驱氧方式均存在工艺复杂、操作繁琐、成本高昂的缺陷，寻找一种便捷、经济的培养方式可解决此难题。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种丁酸梭菌的简易培养方法，能够确保丁酸梭菌的无氧培养环境，同时工艺简化、操作方便，成本低廉。

2、本发明所采用的技术方案为：

3、一种丁酸梭菌的简易培养方法,包括以下操作步骤，

4、s01菌株活化：将冷冻保藏的丁酸梭菌冻存管菌种快速解冻后接种到灭菌液体种子培养基中，37℃静置培养8-12h小时，获得活化好的丁酸梭菌种子；

5、s02种液制备：将活化好的丁酸梭菌种子再次转接到灭菌液体种子培养基中进行扩培，接种量2％，37℃静置培养6-12h小时；

6、s03发酵培养：将步骤s02中的扩培种液接种到灭菌产孢培养基中，静止培养4h；

7、待液面有明显汽泡升腾时，再开启搅拌，搅拌培养至少24小时；

8、取样镜检；

9、若芽孢生成率≥95％，则结束培养；

10、获得丁酸梭菌菌液。

11、进一步地，所述步骤s01和s02中的种子培养基包括以下组分：

12、牛肉膏10g/l，蛋白胨5g/l，酵母浸粉3g/l，葡萄糖5g/l，可溶性淀粉1g/l，氯化钠5g/l，醋酸钠3g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，用10％naoh溶液调ph至6.8，121℃，灭菌15min，制备固体平板时添加20g/l的琼脂。

13、进一步地，所述步骤s03中的产孢培养基包括以下组分：

14、玉米淀粉，大豆蛋白胨，葡萄糖，酵母膏，牛肉膏，feso4·h2o，mgso4·7h2o，caco3，naoh。

15、进一步地，所述步骤s03中的产孢培养基包括以下组分：玉米淀粉30-45g/l，大豆蛋白胨10-15g/l，葡萄糖1-5g/l，酵母膏1-5g/l，牛肉膏1-5g/l，feso4·h2o 0.01-0.1g/l，mgso4·7h2o0.1-1g/l，caco310-30 g/l，用10％naoh溶液调ph至7.2±0.2，121℃灭菌15min。

16、优选地，所述步骤s03的产孢培养基包括以下组分：玉米淀粉35g/l，大豆蛋白胨12g/l，葡萄糖2g/l，酵母膏4g/l，牛肉膏1g/l，feso4·h2o 0.02g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，caco315 g/l，用10％naoh溶液调ph至7.2±0.2，121℃灭菌15min。

17、再进一步地，所述步骤s03中的产孢培养基接种量为3-5％，优选4％。

18、再进一步地，所述步骤s03中的培养温度33-37℃，优选35℃。

19、再进一步地，所述步骤s03中的搅拌转速为30-50rpm，优选50rpm。

20、再进一步地，所述步骤s03中结束培养时ph为5.0-6.0，优选ph5.5。

21、最后，所述步骤s03中的获得的丁酸梭菌的芽孢数不低于7.0x108cfu/ml。

22、本发明的有益效果为：

23、本发明的丁酸梭菌的简易培养方法，采用基于玉米淀粉的产孢培养基接种基于牛肉膏和可溶性淀粉的种子培养基，利用产孢培养基必经的灭菌过程完成驱氧，再借助降温过程培养基逐渐变粘稠的特性维持其无氧状态，接种后丁酸梭菌自身产氢气，使发酵罐内形成正压，进而维持培养阶段的厌氧环境，全程无需充氮驱氧，工艺简单，成本低廉。

24、本发明的丁酸梭菌的简易培养方法，为单批培养，培养过程无需补料、无需调控ph，操作简单，一次性完成。发酵结束后，ph稳定在5-6之间，芽孢数可达7.0x108cfu/ml以上。

技术特征：

1.一种丁酸梭菌的简易培养方法,其特征在于：包括以下操作步骤，

2.根据权利要求1所述丁酸梭菌的简易培养方法,其特征在于：所述步骤s01和s02中的种子培养基包括以下组分：

3.根据权利要求1所述丁酸梭菌的简易培养方法,其特征在于：所述步骤s03中的产孢培养基包括以下组分：

4.根据权利要求1所述丁酸梭菌的简易培养方法,其特征在于：所述步骤s03中的产孢培养基包括以下组分：玉米淀粉30-45g/l，大豆蛋白胨10-15g/l，葡萄糖1-5g/l，酵母膏1-5g/l，牛肉膏1-5g/l，feso4·h2o 0.01-0.1g/l，mgso4·7h2o0.1-1g/l，caco310-30 g/l，用10％naoh溶液调ph至7.2±0.2，121℃灭菌15min。

5.根据权利要求1所述丁酸梭菌的简易培养方法,其特征在于：所述步骤s03的产孢培养基包括以下组分：玉米淀粉35g/l，大豆蛋白胨12g/l，葡萄糖2g/l，酵母膏4g/l，牛肉膏1g/l，feso4·h2o0.02g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，caco315 g/l，用10％naoh溶液调ph至7.2±0.2。

6.根据权利要求1所述丁酸梭菌的简易培养方法,其特征在于：

7.根据权利要求1所述丁酸梭菌的简易培养方法,其特征在于：所述步骤s03中的培养温度33-37℃。

8.根据权利要求1所述丁酸梭菌的简易培养方法,其特征在于：所述步骤s03中的搅拌转速为30-50rpm。

9.根据权利要求1所述丁酸梭菌的简易培养方法,其特征在于：所述步骤s03中结束培养时ph为5.0-6.0。

10.根据权利要求1所述丁酸梭菌的简易培养方法,其特征在于：所述步骤s03中的获得的丁酸梭菌的芽孢数不低于7.0x108cfu/ml。

技术总结
本发明公开了一种丁酸梭菌产芽孢培养基及其制备方法，采用基于玉米淀粉的产孢培养基接种基于牛肉膏和可溶性淀粉的种子培养基，质地粘稠，接种后静置培养，通过利用自身粘稠度隔绝空气，降低溶氧，减少溶氧对丁酸梭菌的生长抑制，能够确保丁酸梭菌的驱氧培养环境，同时工艺简化、操作方便，成本低廉。

技术研发人员：李亚伟,王怡,王东荣
受保护的技术使用者：深圳市东荣生物科技有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15