与黄沙鳖品种鉴定相关的SNP标记及其检测引物组、试剂盒和鉴定方法

本发明涉及分子生物学，尤其涉及与黄沙鳖品种鉴定相关的snp标记及其检测引物组、试剂盒和鉴定方法。

背景技术：

1、黄沙鳖(truogx sinensis)是广西特有的地理种，主要分布于广西左右江、邕江及西江流域。体型钝圆、体色土黄，背甲可见清晰的脊椎骨和肋骨，肉质鲜美，具有较高的营养价值，是当前龟鳖养殖业的热门品种。近年来，在市场发展和社会需求的推动下，黄沙鳖已逐渐成为广西龟鳖养殖的支柱产业对象。然而，大量杂交鳖的出现导致种质混杂情况日益严重，亟需建立一种用于精准鉴定和分类黄沙鳖的有效方法。

2、snp(singlenucleotidepolymorphism)又名单核苷酸多态性，指基因水平上单个碱基出现变异所引起的dna序列多态性，属于第三代遗传标记技术，其具有遗传稳定性强、存在广泛、易实现自动化等优点，目前已被广泛应用于种质鉴定当中。snp检测方法有很多，如高分辨率溶解曲线(hrm)和竞争性等位基因特异性pcr(kasp)、等位基因特异性扩增(as-pcr)等，其中kasp技术是基于终端荧光信号的读取判断来对snp的双等位基因型进行检测，与其他检测手段相比，kasp技术具有成本低、兼容性强、灵敏度高等优势，目前已广泛应用于动植物品种鉴定当中，然而，基于kasp分型技术开发的黄沙鳖品种鉴定snp标记未见报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供与黄沙鳖品种鉴定相关的snp标记及其检测引物组、试剂盒和鉴定方法，用于有效精准鉴定和分类黄沙鳖。

2、本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

3、本发明的第一方面在于提供了一种与黄沙鳖品种鉴定相关的snp标记，所述snp标记包括四个snp分子标记，四个所述snp分子标记分别是：

4、第一snp分子标记，所述第一snp分子标记位于核苷酸序列如seq id no:1所示序列的第136位；

5、第二snp分子标记，所述第二snp分子标记位于核苷酸序列如seq id no:2所示序列的第138位；

6、第三snp分子标记，所述第三snp分子标记位于核苷酸序列如seq id no:3所示序列的第171位；

7、第四snp分子标记，所述第四snp分子标记位于核苷酸序列如seq id no:4所示序列的第176位。

8、结合第一方面，在一些实施例中，四个所述snp分子标记在黄河鳖、洞庭鳖、日本鳖、乌鳖、长永鳖中的基因型为cc、cc、aa、gg，在黄沙鳖中的基因型分别为ct、tt、gg、aa。

9、本发明的第二方面在于提供了用于扩增上述的与黄沙鳖品种鉴定相关的snp标记的引物组。

10、结合第二方面，在一些实施例中，所述引物组均独立地包括一条5’末端含有fam标签的正向引物和一条5’末端含有hex标签的正向引物，以及一条反向引物。

11、结合第二方面，在一些实施例中，所述引物组包括：

12、第一snp引物组，用于扩增所述第一snp分子标记，包括核苷酸序列如seq id no:5所示的第一正向引物和核苷酸序列如seq id no:6所示的第二正向引物，以及核苷酸序列如seq id no:7所示的第一反向引物；

13、第二snp引物组，用于扩增所述第二snp分子标记，包括核苷酸序列如seq id no:8所示的第三正向引物和核苷酸序列如seq id no:9所示的第四正向引物，以及核苷酸序列如seq id no:10所示的第二反向引物；

14、第三snp引物组，用于扩增所述第三snp分子标记，包括核苷酸序列如seq id no:11所示的第五正向引物和核苷酸序列如seq id no:12所示的第六正向引物，以及核苷酸序列如seq id no:13所示的第三反向引物；

15、第四snp引物组，用于扩增所述第四snp分子标记，包括核苷酸序列如seq id no:14所示的第七正向引物和核苷酸序列如seq id no:15所示的第八正向引物，以及核苷酸序列如seq id no:16所示的第四反向引物。

16、本发明的第三方面在于提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物组。

17、本发明的第四方面在于提供了上述引物组或试剂盒的以下任一应用：

18、(1)在鉴定或辅助鉴定黄沙鳖品种中的应用；

19、(2)在黄沙鳖分子标记辅助育种中的应用；

20、(3)在黄沙鳖育种中的应用；

21、(4)在制备黄沙鳖育种的产品中的应用。

22、本发明的第五方面在于提供了一种黄沙鳖品种鉴定方法，包括如下步骤：

23、s1.从待检测的样本中提取鳖的裙边组织基因组dna；

24、s2.采用上述引物组对上述snp标记分别进行pcr扩增，并对扩增产物进行荧光信号扫描；

25、s3.根据所述荧光信号分析每个样本分别在四个所述snp分子标记位点的基因型；

26、s4.得出结论，若四个所述snp分子标记位点的基因型分别为ct、tt、gg、aa，样本为黄沙鳖，若四个所述snp分子标记位点的基因型分别为cc、cc、aa、gg，样本为黄河鳖、洞庭鳖、日本鳖、乌鳖、长永鳖中的一种。

27、结合第五方面，在一些实施例中，所述pcr扩增的反应体系包括：样本dna 5μl、kasp引物混合物0.14μl；kasp mix 5μl。

28、结合第五方面，在一些实施例中，所述pcr扩增的反应条件为：

29、预变性，温度94℃，时间15min，1个循环；

30、变性，温度94℃，时间20sec，复性/延伸61-55℃，时间60sec，10个循环；

31、变性，温度94℃，时间20sec，复性/延伸55℃，时间60sec，26个循环。

32、本发明针对当前黄沙鳖种质资源混杂的现象，提供了一种基于kasp技术鉴定黄沙鳖种质的snp标记组合，通过筛选出一套共四个高质量和高多态性的snp标记，可用于来源不同的鳖的品种中实现对黄沙鳖的精准检测，具有广泛的应用普适性。而且本发明的snp标记为共显性标记，特异性、灵敏度和分辨力高，该snp标记不受环境条件影响，检测结果准确、重复性和稳定性较好。本发明在鉴定黄沙鳖品种的应用中，具有灵敏度高、稳定性强、检测成本低，操作简便快捷等优点，适用于对群体进行大批量验证。

技术特征：

1.与黄沙鳖品种鉴定相关的snp标记，其特征在于，所述snp标记包括四个snp分子标记，四个所述snp分子标记分别是：

2.根据权利要求1所述的与黄沙鳖品种鉴定相关的snp标记，其特征在于，四个所述snp分子标记在黄河鳖、洞庭鳖、日本鳖、乌鳖、长永鳖中的基因型为cc、cc、aa、gg，在黄沙鳖中的基因型分别为ct、tt、gg、aa。

3.用于扩增如权利要求1或2所述的与黄沙鳖品种鉴定相关的snp标记的引物组。

4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述引物组均独立地包括一条5’末端含有fam标签的正向引物和一条5’末端含有hex标签的正向引物，以及一条反向引物。

5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括：

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求5所述的引物组。

7.根据权利要求4或5所述的引物组或权利要求6所述的试剂盒的以下任一应用：

8.一种黄沙鳖品种鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的一种黄沙鳖品种鉴定方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系包括：样本dna 5μl、kasp引物混合物0.14μl；kasp mix 5μl。

10.根据权利要求8所述的一种黄沙鳖品种鉴定方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应条件为：

技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及与黄沙鳖品种鉴定相关的SNP标记及其检测引物组、试剂盒和鉴定方法，SNP标记包括：位于核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示序列的第136位、位于核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示序列的第138位、位于核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示序列的第171位和位于核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示序列的第176位，检测引物组用于扩增上述的与黄沙鳖品种鉴定相关的SNP标记，可应用在(1)在鉴定或辅助鉴定黄沙鳖品种中，(2)在黄沙鳖分子标记辅助育种中，(3)在黄沙鳖育种中，(4)在制备黄沙鳖育种的产品中。本发明在鉴定黄沙鳖品种的应用中，具有灵敏度高、稳定性强、检测成本低，操作简便快捷等优点，适用于对群体进行大批量验证。

技术研发人员：胡亚洲,梁艺馨,王子奥,王佩,葛玲瑞,秦溱,曾丹,周先文,熊钢,王晓清
受保护的技术使用者：湖南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15