利用肌球蛋白激活剂或Piezo1激活剂由人多能干细胞分化获得定型内胚层细胞的方法

本发明涉及干细胞和再生医学领域，特别涉及一种利用肌球蛋白激活剂或piezo1激活剂由人多能干细胞分化获得定型内胚层细胞的方法和培养基。

背景技术：

1、具有多能性的胚胎干细胞(embryonic stem cell，esc)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，ipsc)是一群能够发育成为胎儿体内所有类型细胞，且几乎无限自我更新的特殊细胞。对于多能干细胞的研究不仅可以揭示人类发育的过程，填补目前对于人类胚胎早期发育的知识空白，探寻在发育过程中扮演重要角色的信号分子或信号刺激。与此同时，多能干细胞还可以通过体外分化的方式形成和体内器官相似的类组织、类器官，这一过程不仅可以作为发育性疾病的模型，揭示疾病发生发展过程中的机制以实现有的放矢地治疗；还能够作为再生医学的供体来源，以缓解目前器官移植中供体短缺的困境。

2、多能干细胞可以朝向内、中、外三胚层谱系分化，其中内胚层后续可发育成为肝脏、胃、胰腺、肠等消化系统。在体外，利用定型内胚层细胞分化获得的肝脏类器官能够有效模拟脂肪肝和药物肝损伤的疾病发展过程，为肝脏疾病提供新的治疗思路；利用定型内胚层细胞分化获得的胰岛类器官能够在移植后有效控制糖尿病患者的血糖水平，有望解决胰岛移植中供体严重短缺的问题。

3、因此，有必要开发一种能够更快、更高效获得定型内胚层细胞的培养基和培养方法。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种利用肌球蛋白激活剂或piezo1激活剂由人多能干细胞分化获得定型内胚层细胞的方法，通过向基本培养基中添加calyculin a、yoda1中的至少一种，以提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供一种肌球蛋白激活剂calyculin a的应用，所述应用包括：加入肌球蛋白激活剂calyculin a提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率。

4、在本发明的第二方面，提供一种piezo1激活剂yoda1的应用，所述应用包括：加入piezo1激活剂yoda1提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率。

5、在本发明的第三方面，一种利用肌球蛋白激活剂或piezo1激活剂提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率的方法，所述方法包括：使用calyculina、yoda1其中的至少一种对哺乳动物多能干细胞进行培养。

6、具体地，肌球蛋白激活剂也可扩展为其他小分子，例如omecamtiv mecarbil、danicamtiv等；piezo1激活剂也可扩展为其他小分子，例如jedi2。

7、在本发明的第四方面，提供一种用于哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率的培养基，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加calyculin a、yoda1中的至少一种。

8、进一步地，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加1～100ng/ml activina、b27、牛血清白蛋白、双抗，以及calyculin a、yoda1中的至少一种。

9、进一步地，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加1～100ng/ml activina、0.5～1.5％ b27、0.1～0.3％牛血清白蛋白、0.5～1.5％双抗，以及以下化合物中的一种：

10、化合物a：0.2-0.5nm calyculin a；

11、化合物b：0.5nm calyculin a+2％蔗糖；

12、化合物c：2-5μm yoda1；

13、化合物d：2μm yoda1+2％蔗糖；

14、进一步地，所述培养基的组分还包括：2～3μm gsk3抑制剂。具体地，gsk3抑制剂可以为例如chir99021或者wnt信号传导激活剂，例如wnt3a。

15、在其他实施方式中，所述培养基还可包含组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂，例如，曲古抑菌素a、丁酸钠(nab)、恩替司他(entinostat)、丁酸苯酯(pb)、帕比司他(panobinstat)或丙戊酸盐/酯(valproate)。所述分化培养基还可包含一种或更多种生长因子，例如fgf1、fgf2和fgf4和/或血清，例如fbs或fcs。所述分化培养基还可包含pi3k(磷酸肌醇3-激酶)抑制剂，例如ly294002。

16、进一步地，所述哺乳动物多能干细胞的类型包括：哺乳动物胚胎干细胞或哺乳动物诱导多能干细胞。

17、具体地，所述哺乳动物多能干细胞包括：人多能干细胞、灵长类动物多能干细胞、小鼠多能干细胞、大鼠多能干细胞、犬多能干细胞、猫多能干细胞、猪多能干细胞、牛多能干细胞和马多能干细胞中的一种。

18、在本发明的第五方面，提供一种哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养方法，所述方法包括：采用所述的培养基对哺乳动物多能干细胞进行培养，以使分化成定型内胚层细胞。

19、进一步地，所述方法包括：

20、将哺乳动物多能干细胞使用生长培养基进行培养3-6天，后消化计数并接种于包被有基质胶的孔板内，采用正常生长培养基培养；

21、待达到75～85％的密度，换上所述的培养基进行培养，获得定型内胚层细胞。

22、上述技术方案中，所述生长培养基具体可以为mtesr+1％双抗，基质胶以1：100稀释比例包被于板孔内，在其他实施方式中也可适当调整添加比例；

23、上述技术方案中，对于24孔板，所述消化计数后按0.8x105每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的24孔板内；在其他实施方式中，对于不同的培养皿，适当相应调整接种的细胞数。

24、本发明的calyculin a全称为花萼海绵体诱癌素a，calyculin a抑制平滑肌肌球蛋白b内源性磷酸酶的活性，诱导肌肉纤维收缩。

25、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

26、本发明提供的利用肌球蛋白激活剂或piezo1激活剂提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率的培养基和培养方法，通过向基本培养基中添加calyculin a、yoda1中的至少一种，以提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率；具体地：

27、(1)培养基中加入calyculin a、yoda1中的至少一种，使多能干细胞分化第3天时即可达到较高的分化效率，可以缩短分化时间。

28、(2)本发明提供的培养基，成本较低，性能稳定，可以将人多能干细胞高效率地分化为定型内胚层细胞。这为体外进行内胚层相关发育问题的研究提供了一个低成本高效率的研究体系。同时也降低了再生医学的应用成本，这将极大地促进细胞疗法的研究与应用，有着很好的应用前景。

技术特征：

1.一种肌球蛋白激活剂calyculin a的应用，其特征在于，所述应用包括：加入肌球蛋白激活剂calyculin a提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率。

2.一种piezo1激活剂yoda1的应用，其特征在于，所述应用包括：加入piezo1激活剂yoda1提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率。

3.一种利用肌球蛋白激活剂或piezo1激活剂提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率的方法，其特征在于，所述方法包括：使用calyculin a、yoda1中的至少一种对哺乳动物多能干细胞进行培养。

4.一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基，其特征在于，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加calyculin a、yoda1中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基，其特征在于，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加100ng/ml activin a、b27、牛血清白蛋白、双抗，以及calyculin a、yoda1中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基，其特征在于，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加1～100ng/ml activin a、0.5～1.5％b27、0.1～0.3％牛血清白蛋白、0.5～1.5％双抗，以及以下化合物中的一种：

7.根据权利要求6所述的一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基，其特征在于，所述培养基的组分还包括：2～3μm gsk3抑制剂。

8.根据权利要求6所述的一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基，其特征在于，所述哺乳动物多能干细胞的类型包括：哺乳动物胚胎干细胞或哺乳动物诱导多能干细胞。

9.一种哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求4-8任一项所述的培养基对哺乳动物多能干细胞进行培养，以使分化成定型内胚层细胞。

10.根据权利要求9所述的一种哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括：

技术总结
本发明公开了一种利用肌球蛋白激活剂或Piezo1激活剂由人多能干细胞分化获得定型内胚层细胞的方法和培养基，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加Calyculin A(肌球蛋白激活剂)、Yoda1(Piezo1激活剂)中的至少一种。所述方法包括：采用所述的培养基对哺乳动物多能干细胞进行培养，以使分化成定型内胚层细胞。本发明通过向基本培养基中添加Calyculin A、Yoda1的其中一种，以提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率；本发明提供的培养基，成本较低，性能稳定，可以将人多能干细胞高效率地分化为定型内胚层细胞。这为体外进行内胚层相关发育问题的研究提供了一个低成本高效率的研究体系。同时也降低了再生医学的应用成本。

技术研发人员：蒋卫,姜来
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15