一种利用全细胞转化高效生产苯丙酮酸的方法

本发明公开了一种利用全细胞转化高效生产苯丙酮酸的方法，属于分子生物技术与酶工程。

背景技术：

1、苯丙酮酸是人体必需氨基酸即苯丙氨酸生物合成前体，是复方α-酮酸片的重要原料,为肾病患者提供必需氨基酸并尽量减少氨基氮的摄入，由于其不含氨基,可减少尿素合成,尿毒症毒性产物的蓄积也得以减少。现苯丙酮酸的合成主要是化学合成：以1-苯基2-丙酮为原料，经氧化反应生成苯丙酮酸；或以苯乙酸为原料，与氰代磷酸二乙酯反应，再经水解、氧化苯丙酮酸。上述化学合成法原料不易得，反应条件苛刻，成本高，且对环境污染大，不适合工业化生产。

2、l-氨基酸脱氨酶，存在于真菌、放线菌、细菌中，是一类fad依赖型黄素酶，在有氧条件下，直接氧化l-氨基酸产生对应的酮酸和氨。在日用化学品、医药合成、食品加工等领域广泛使用。用l-氨基酸脱氨酶催化合成相应的酮酸，整个过程高效，产品质量稳定，且不含有毒有害的强酸、重金属等成分，产生生物安全性好，可用于化妆品、医药等高附加值的领域。但目前l-氨基酸脱氨酶的酶活较低，且使用全细胞催化需要在缓冲体系下进行反应，不利于产品的分离纯化，影响其工业化运用。

技术实现思路

1、技术问题：化学制备苯丙酮酸的方法中，存在产品杂质过多，不易精制，后处理步骤繁琐，成本高等问题，不适合工业上大规模生产。

2、技术方案：本发明公开了一种利用全细胞转化高效生产苯丙酮酸的方法,并利用l-氨基酸脱氨酶改造一定程度上提高了苯丙酮酸的产量和转化率，构建了以大肠杆菌为宿主的高产苯丙酮酸的工程菌。

3、本发明通过在大肠杆菌细胞中异源表达合成苯丙酮酸的关键酶并进行改造。最后，通过全细胞催化体系的优化，实现了苯丙酮酸的高效生产(图1)。本研究为开发大规模生产苯丙酮酸及相关化合物的生物转化系统提供了借鉴。

4、本发明的提供了一种l-氨基酸脱氨酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如seqid no.2所示的野生型酶的第79位苏氨酸突变为丙氨酸、第119位谷氨酸突变为丙氨酸、第314位谷氨酸突变为丙氨酸、第386位丝氨酸突变为丙氨酸和第391位谷氨酸突变为丙氨酸。

5、本发明提供了编码上述l-氨基酸脱氨酶突变体的基因。

6、本发明提供了携带所述l-氨基酸脱氨酶突变体或所述基因的载体。

7、在一种实施方式中，所述载体以pet系列质粒为表达载体。

8、在一种实施方式中，以pet-28a(+)质粒为表达载体。

9、本发明提供了携带所述基因或所述载体的宿主细胞。

10、在一种实施方式中，所述宿主细胞包括微生物细胞。

11、本发明提供了一种高效生产苯丙酮酸的工程菌，所述工程菌表达所述l-氨基酸脱氨酶突变体。

12、在一种实施方式中，所述工程菌以大肠杆菌为宿主。

13、在一种实施方式中，所述工程菌以pet系列质粒为表达载体。

14、在一种实施方式中，所述大肠杆菌为escherichia coli bl21(de3)。

15、本发明提供了一种全细胞催化剂，所述全细胞催化剂含有所述工程菌。

16、本发明提供了一种全细胞催化制备苯丙酮酸的方法，所述方法为将所述工程菌或所述全细胞催化剂添加至l-苯丙氨酸溶液中催化制备苯丙酮酸。

17、在一种实施方式中，所述方法的步骤如下：

18、(1)将所述工程菌或所述全细胞催化剂的种子液接种于发酵培养基中，培养至od600为15～20，添加诱导剂诱导培养10～20h，离心收集湿菌体；

19、(2)将湿菌体接种于l-苯丙氨酸溶液中，在ph6.5～8.5，30～50℃条件下反应6～24h。

20、在一种实施方式中，所述l-苯丙氨酸溶液是由自来水、tris-hcl、氨水-氯化铵或pbs配制得到的。

21、在一种实施方式中，所述l-苯丙氨酸浓度为40～60g/l。

22、在一种实施方式中，所述湿菌体的浓度为30～50g/l。

23、本发明提供了所述l-氨基酸脱氨酶突变体，或所述基因，或所述载体，或所述宿主细胞，或所述工程菌，或所述全细胞催化剂，或所述方法在制药、食品或化工领域中的应用。

24、本发明还提供了所述l-氨基酸脱氨酶突变体，或所述基因，或所述载体，或所述宿主细胞，或所述工程菌，或所述全细胞催化剂，或所述方法在制备苯丙酮酸中的应用。

25、有益效果：

26、本发明通过对pmylaad进行蛋白质改造，验证得到突变体pmylaadt79a/e119a/e314a/s386a/e391a在提高酶活的同时提高苯丙酮酸产量，克服了之前野生型酶催化效率低的问题。本发明对转化体系的催化剂浓度、缓冲液种类、ph和温度进行优化，利用突变体pmylaadt79a/e119a/e314a/s386a/e391a在以自来水为溶剂的催化体系中，反应8h时苯丙酮酸的产量可达到42.72g/l，转化率>80％。本发明提供的突变体pmylaadt79a/e119a/e314a/s386a/e391a和全细胞催化剂在提高底物利用率的同时，降低了产物分离纯化的难度与成本，有效缩短产品制备时间的并降低成本，加快了全细胞转化法生产苯丙酮酸的工业化进程。

技术特征：

1.一种l-氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如seq idno.2所示的野生型酶的第79位苏氨酸突变为丙氨酸、第119位谷氨酸突变为丙氨酸、第314位谷氨酸突变为丙氨酸、第386位丝氨酸突变为丙氨酸和第391位谷氨酸突变为丙氨酸。

2.编码权利要求1所述l-氨基酸脱氨酶突变体的基因。

3.携带权利要求1所述l-氨基酸脱氨酶突变体或权利要求2所述基因的载体。

4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述载体的宿主细胞。

5.一种高效生产苯丙酮酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌表达权利要求1所述l-氨基酸脱氨酶突变体。

6.一种全细胞催化剂，其特征在于，所述全细胞催化剂含有权利要求5所述工程菌。

7.一种全细胞催化制备苯丙酮酸的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求5所述工程菌或所述全细胞催化剂添加至l-苯丙氨酸溶液中催化制备苯丙酮酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述l-苯丙氨酸溶液是由自来水、tris-hcl、氨水-氯化铵或pbs配制得到的。

9.权利要求1所述l-氨基酸脱氨酶突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述载体，或权利要求4所述宿主细胞，或权利要求5所述工程菌，或权利要求6所述全细胞催化剂，或权利要求7或8所述方法在制药、食品或化工领域中的应用。

10.权利要求1所述l-氨基酸脱氨酶突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述载体，或权利要求4所述宿主细胞，或权利要求5所述工程菌，或权利要求6所述全细胞催化剂，或权利要求7或8所述方法在制备苯丙酮酸中的应用。

技术总结
本发明公开了一种利用全细胞转化高效生产苯丙酮酸的方法，属于分子生物技术与酶工程技术领域。本发明通过对pmyLAAD进行蛋白质改造，验证得到突变体pmyLAADT79A/E119A/E314A/S386A/E391A在提高酶活的同时提高苯丙酮酸产量。本发明利用突变体pmyLAADT79A/E119A/E314A/S386A/E391A在以自来水为溶剂的催化体系中，苯丙酮酸的产量可达到42.72g/L，转化率>80％。本发明提供的突变体和全细胞催化剂在提高底物利用率的同时，降低了产物分离纯化的难度与成本，有效缩短产品制备时间的并降低成本，加快了全细胞转化法生产苯丙酮酸的工业化进程。

技术研发人员：饶志明,王玥,石选平,徐美娟,杨套伟,张显
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25