番茄SlMYB32基因作为负调控因子在提高番茄果实芦丁含量中的应用

本发明涉及基因工程、分子生物学及生理学等领域，具体地说，涉及番茄slmyb32基因作为负调控因子在提高番茄果实芦丁含量中的应用。

背景技术：

1、随着人们生活水平的提高和对“膳食与健康”认识的不断深入，果蔬等园艺产品的营养保健品质日益受到重视，在园艺产品中富集与健康有关的活性物质已成为现今植物学研究的一个热点，也是园艺产业可持续发展的新支撑点。

2、芦丁，又称为维生素p，是一种天然的黄酮醇衍生物，广泛存在于果蔬中。大量研究报道芦丁具有抗癌、抗糖尿病、保护心血管、抗炎、抗氧化、抗菌等药理活性，特别是具有用于化疗和化学预防的潜力。因此，植物芦丁生物合成及其调控机制研究逐渐成为热点。r2r3-myb型转录因子在调控植物芦丁等黄酮醇化合物积累中发挥重要作用。目前关于植物黄酮醇生物合成调控研究多集中于r2r3-myb激活子，比如拟南芥atmyb12、番茄slmyb12、苹果mdmyb22、桃ppmybf1和ppmyb15、苦荞麦ftmyb116等。但是，有关黄酮醇生物合成相关抑制子的研究鲜有报道。早期研究发现草莓中famyb1与bhlhs蛋白互作，抑制黄酮醇与花色苷的积累；近年来，苦荞麦ftmyb11被证明直接靶向负调控chs1、fls等黄酮醇生物合成结构基因，从而抑制芦丁积累。然而，r2r3-myb抑制子调控果实芦丁生物合成的分子机制仍未明晰，有待深入研究。

3、番茄原产地为南美洲热带地区，是世界上栽培最广泛的蔬菜作物之一，也是我国栽培面积最大的设施蔬菜作物。番茄果实富含芦丁等类黄酮化合物，而且是研究果实性状最重要的模式植物，因其生长周期短、基因组完整公开等优势而被广泛应用于代谢工程和种质创新。然而，目前针对植物芦丁生物合成相关抑制子的代谢工程研究未见报道。

4、近年来，crispr/cas9基因编辑技术得到了迅速地发展，相比于传统育种，该技术能够精准敲除基因组中的基因，从而精准改变农作物的性状，大大缩短育种时间。利用该技术，将番茄中的slmyb32基因敲除，进而提高番茄果实芦丁含量以及挖掘生物活性物质合成的基因资源。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明实施例提供一种番茄slmyb32基因作为负调控因子在提高番茄果实芦丁含量中的应用。通过crispr/cas9基因编辑技术使得所述番茄slmyb32基因被敲除；所述番茄slmyb32基因的核苷酸序列如seq:no.1所示。

2、本实例中番茄slmyb32基因为以下1)-4)中的任意一种核苷酸序列：

3、1)seq:no.1所示的核苷酸序列；

4、2)seq:no.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有不改变原核苷酸序列功能的核苷酸序列；

5、3)在严格条件下与seq:no.1所示序列杂交获得的具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；

6、4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

7、由上述的番茄slmyb32基因编码获得的蛋白质，该蛋白质具有以下之一的氨基酸序列：

8、1)seq:no.2所示的氨基酸序列；

9、2)seq:no.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

10、应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。应理解，考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

11、为了实现本发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

12、slmyb32基因作为负调控因子在提高番茄果实芦丁含量中的应用，所述slmyb32基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seq:no.1所示，所述应用的途径为通过敲除slmyb32基因使番茄果实芦丁含量得到提高。

13、进一步地，所述基因敲除技术具体如下：

14、在番茄slmyb32基因的蛋白编码区选取含有前间区序列邻近基序pam结构的靶标片段，以其前20个碱基为依据，设计相应引物，构建crispr/cas9植物表达载体；

15、将crispr/cas9植物表达载体导入宿主细胞中，再利用其侵染目的植株，筛选阳性转基因植株，获得番茄果实富含芦丁的转基因植株。

16、进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，所述宿主细胞优选为eha105农杆菌细胞。

17、进一步地，所述植物表达载体为具有35s启动子的表达载体。

18、进一步地，所述表达载体为载体pylcrispr/cas9-pubi-h。

19、进一步地，所述含有前间区序列邻近基序pam结构的前20个碱基的核苷酸序列如图1所示。

20、本发明的有益效果如下：通过基因敲除技术构建番茄slmyb32基因敲除植株，调控所述基因slmyb32的蛋白水平来研究其对番茄果实芦丁生物合成的调控机制，结果发现，slmyb32基因敲除植株番茄果实芦丁含量显著提高。本发明为培育富含生物活性物质的番茄新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为番茄及其他园艺作物营养品质改良研究奠定了理论基础。

21、本发明首次构建了番茄slmyb32基因敲除植株，并进行功能研究，发现slmyb32基因在番茄果实芦丁生物合成中起到负调控的作用。

22、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。

技术特征：

1.番茄slmyb32基因作为负调控因子在提高番茄果实芦丁含量中的应用，其特征在于，所述slmyb32基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seq:no.1所示，所述应用的途径为通过敲除slmyb32基因使番茄果实芦丁含量得到提高。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因敲除技术具体如下：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞优选为eha105农杆菌细胞。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体为具有35s启动子的表达载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述表达载体为载体pylcrispr/cas9-pubi-h。

技术总结
本发明公开了一种番茄SlMYB32基因作为负调控因子在提高番茄果实芦丁含量中的应用，所述SlMYB32基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，所述应用的途径为通过敲除SlMYB32基因使番茄果实芦丁含量得到提高。本发明为培育富含生物活性物质的新品种提供了基因资源，证明了SlMYB32基因作为负调控因子在提高番茄果实芦丁含量中的用途，为番茄及其他园艺作物营养品质改良研究奠定了理论基础。

技术研发人员：李鲜,曹运琳,马颖越,徐昌杰,石艳娜,陈昆松,张文娜
受保护的技术使用者：浙江大学山东（临沂）现代农业研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15