一种适用于现场检测的猪禽流感快速检测方法与流程

本发明属于生物检测，具体涉及一种适用于现场检测的猪禽流感快速检测方法。

背景技术：

1、猪流感病毒是引起猪呼吸道疾病的重要病原之一，尽管猪流感所导致的死亡率不高，与其他病毒性猪传染病相比,造成的经济损失也小得多，但长期以来，它一直是各国兽医学家和流感专家研究的热点，猪是禽、猪、人流感病毒唯一的共同易感宿主，siv还可以感染人和禽，已有报道h3n2亚型、h1n1亚型siv传染给人，而且目前猪流感病毒在国内猪群中流行的主要是hl和h3亚型，而siv所造成的病毒基因的重排以及人流感病毒株的流行，就使得疾病的监测和疫苗效果更加复杂化。

2、目前检测猪禽流感的主要方式是荧光实时定量rt-pcr，但荧光pcr要求专业的设备以及专业的技术人员操作,而h5亚型禽流感多发病于并不具备专业设备以及专业技术人员的基层养殖场和偏远地区，因此建立适合基层现场的快速且灵敏的分子生物学检测方法，成为防控h5亚型禽流感的重要措施之一。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的上述不足，本发明的目的之一在于提供一种适用于现场检测的猪禽流感快速检测方法，所述具体检测方法如下：

2、s1、h1n1猪流感病毒cdna的制备，从处理过的灭活病毒中提取病毒rna并反转录为cdna，用作lamp反应的模板；

3、s2、引物的设计与合成，分析h1n1猪流感ha、na基因序列，然后在ha、na的保守区各设计2对引物；

4、s3、h1n1 lamp扩增反应，在bst dna聚合酶大片段和dna模板混合液中，加双蒸水补足至25ul；混匀后65℃温浴60min，产物于2.0％的琼脂糖凝胶电泳分析；

5、s4、灵敏度检验，取猪流感病毒部分片段阳性克隆，摇均后提取质粒，测定吸光值，换算为核酸含量，然后作10倍系列稀释,以各稀释物为模板分别进行lamp扩增；

6、s5、特异性检验，分别以h9型禽流感病毒、猪流感毒和猪圆环病毒作为待测样品，其中h9型禽流感病毒和猪流感病毒核酸反转录为cdna后使用，以经depc处理的水为阴性对照，检验lamp方法的特异性；

7、s6、样品检测，用鼻拭子擦拭猪禽的口腔，然后用适量生理盐水洗涤拭子，离心取上清，加入trizol抽提核酸，然后用建立的lamp技术和pcr方法进行检测。

8、进一步地，所述混合液分别在65℃反应45min、50min、55min、60min、70min和80min，反应结束后，取5ul产物与1ul的6倍溴酚蓝上样缓冲液混合，2％琼脂糖凝胶电泳，eb染色后通过凝胶成像系统成像，根据电泳结果确定最佳反应时间。

9、进一步地，所述混合液分别在55℃、60℃、62℃、64℃、65℃反应60min，反应结束后取5ul产物与1ul的6倍溴酚蓝上样缓冲液混合，2％琼脂糖凝胶电泳，eb染色后通过凝胶成像系统成像，根据电泳结果确定最佳反应温度。

10、进一步地，所述h1n1 lamp引物分别对h1n1亚型siv、h9亚型aiv和pcv-2的cdna模板进行lamp反应。

11、与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

12、本发明提供的一种适用于现场检测的猪禽流感快速检测方法，本发明建立的h1n1亚型猪流感病毒lamp检测方法主要是利用了bst dna聚合酶在60℃～65℃具有解旋功能和瀑布式扩增功能,在等温的情况下即可实现核酸的变性，并且由于lamp的扩增效率非常高，短时间内达到大量扩增，反应过程中可产生大量的焦磷酸镁而使反应液呈现混浊；在反应液中加入染料，如果有扩增染料嵌入双链中可导致反应液颜色由橘黄色变为绿色，因此在lamp扩增结束后无须电泳就可直接通过肉眼观察反应液是否出现混浊或者颜色改变来判断结果阴阳性，这些设计可以在基层甚至现场实现对猪禽流感病毒的即时检测。

技术特征：

1.一种适用于现场检测的猪禽流感快速检测方法，其特征在于：所述具体检测方法如下：

2.权利要求1所述的一种适用于现场检测的猪禽流感快速检测方法，其特征在于：所述混合液分别在65℃反应45min、50min、55min、60min、70min和80min，反应结束后，取5ul产物与1ul的6倍溴酚蓝上样缓冲液混合，2％琼脂糖凝胶电泳，eb染色后通过凝胶成像系统成像，根据电泳结果确定最佳反应时间。

3.权利要求1所述的一种适用于现场检测的猪禽流感快速检测方法，其特征在于：所述混合液分别在55℃、60℃、62℃、64℃、65℃反应60min，反应结束后取5ul产物与1ul的6倍溴酚蓝上样缓冲液混合，2％琼脂糖凝胶电泳，eb染色后通过凝胶成像系统成像，根据电泳结果确定最佳反应温度。

4.权利要求1所述的一种适用于现场检测的猪禽流感快速检测方法，其特征在于：所述h1n1 lamp引物分别对h1n1亚型siv、h9亚型aiv和pcv-2的cdna模板进行lamp反应。

技术总结
本发明公开了一种适用于现场检测的猪禽流感快速检测方法，属于生物检测技术领域，H1N1猪流感病毒cDNA的制备，引物的设计与合成，分析H1N1猪流感HA、NA基因序列，然后在HA、NA的保守区各设计2对引物，H1N1LAMP扩增反应，灵敏度检验，特异性检验，样品检测，用鼻拭子擦拭猪禽的口腔，然后用适量生理盐水洗涤拭子，离心取上清，加入Trizol抽提核酸，然后用建立的LAMP技术和PCR方法进行检测，本研究建立的H1N1亚型猪流感病毒LAMP检测方法主要是利用了Bst DNA聚合酶在60℃～65℃具有解旋功能和瀑布式扩增功能,在等温的情况下即可实现核酸的变性，并且由于LAMP的扩增效率非常高，可以在基层甚至现场实现对猪禽流感病毒的即时检测。

技术研发人员：蔡杰,许芳,蒋永青,黎一锋,凌远佳,高帅鹏
受保护的技术使用者：深圳市绿诗源生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15