铈组装碳点水凝胶磷酸酶、其制备方法及在对氧磷检测中的应用

本发明属于光学传感，具体涉及铈组装碳点水凝胶磷酸酶、其制备方法及在对氧磷检测中的应用。

背景技术：

1、对氧磷是广泛使用于农作物病虫害防治的有机磷农药之一，过度地使用对氧磷会严重污染环境和威胁人类身体健康，如神经性疾病、呼吸和分泌系统失调和心血管疾病等，因此，有必要开发一种便携、快速、可靠和灵敏检测对氧磷的方法。近年来，检测对氧磷的方法很多，如色谱法、电泳法、酶联免疫分析法、电化学等。目这些方法虽然准确灵敏，但是常常存在许多缺点，例如检测的成本高，耗时长，检测仪器巨大而不方便携带且需要熟练的测试人员。因此开发经济、便捷和灵敏的检测对氧磷的方法是十分有必要的。

2、具有碱性磷酸酶活性的纳米酶催化材料因其低成本、稳定性高和易于制备等优势引起我们的关注。另一方面，水凝胶是一类极为亲水的三维网状结构聚合物，具有良好的生物相容性和柔韧性。因此，许多研究人员开始具有碱性磷酸酶活性的水凝胶，如金纳米团簇/海藻酸盐水凝胶、碱性磷酸酶/脂肪酶复合水凝胶和碱性磷酸酶-水凝胶等，但是其成本高，操作复杂，限制了进一步应用。因此，研究和开发易于大规模生产，环保无毒且成本低廉的碱性磷酸酶活性的水凝胶具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术中的不足与难题，铈组装碳点水凝胶磷酸酶的制备方法及其在对氧磷检测的应用，其具有检测便捷、高灵敏、和宽检测范围的优点。

2、本发明通过以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种铈组装碳点水凝胶磷酸酶的制备方法，该方法以2-甲基咪唑和1，2，3，4-丁烷四羧酸为源料，通过水热法一步制备碳点，继而以ce3+为催化中心得到铈组装碳点水凝胶磷酸酶该方法包括以下步骤：

4、s1、在容器内依次加入0.5g1，2，3，4-丁烷四羧酸、0.0351-0.5259g质量份的2-甲基咪唑、加入20ml超纯水，混合均匀，转移至50ml高压反应釜中；

5、s2、并将该混合物溶液在120～220℃加热4～24h。冷却至室温后，经过12000rpm/min离心10min，收集上清液，并用0.22μm滤膜过滤，将滤液进行冷冻干燥，然后用溶剂洗涤3次，用旋转蒸发仪旋蒸除去溶剂得到纯净的碳点，加入适量的水配制20mg/ml碳点水溶液；

6、s3、取上述s2中溶液1000体积份，加入50-800体积份的硝酸铈，摇匀得到凝胶，将该凝胶以12000rpm/min离心10min，弃去上清液，并用超纯水洗涤三次，冷冻干燥得到纯净的铈组装碳点水凝胶磷酸酶。

7、作为优选，步骤s1中1，2，3，4-丁烷四羧酸用量为0.3506g重量份；所述步骤s2中反应温度为200℃；加热时间为12h；溶剂为丙酮；所述步骤s3中硝酸铈用量为200体积份，其浓度为1m。

8、本发明还提供了上述方法制备的铈组装碳点水凝胶磷酸酶。

9、本发明还提供了上述铈组装碳点水凝胶磷酸酶的应用，铈组装碳点水凝胶磷酸酶用于对氧磷检测。

10、具体应用方法为：

11、a.比色/荧光传感器构建：

12、(1)制备多组检测液：将100体积份铈组装碳点水凝胶磷酸酶浓度1mg/ml、200体积份的碳酸-碳酸钠缓冲溶液、分别加入20体积份不同浓度的对氧磷溶液、并1680份体积水，得到多组检测液；

13、(2)将各组检测液混合均匀，50℃反应30min；

14、(3)对步骤(2)制得混合检测液测量紫外-可见吸收光谱；

15、(4)并根据不同浓度的对氧磷对应的氧化产物4-对硝基苯酚在400nm处的吸收峰强度之间的关系来检测对氧磷；

16、随着对氧磷浓度的增加，氧化产物4-对硝基苯酚在400nm处吸收峰强度逐渐增强，对氧磷浓度与4-对硝基苯酚的吸光度在5-100μm范围内呈线性关系，检出限1.2μm。

17、(5)对步骤(2)制得检测液中加入5体积份5，7-二甲基香豆素，混合均匀；

18、(6)对步骤(5)制得的检测液，测试荧光光谱，激发光谱为330nm；

19、(7)并根据不同浓度的对氧磷对应的5，7-二甲基香豆素荧光强度之间的关系来检测对氧磷；

20、随着对氧磷浓度的增加，5，7-二甲基香豆素荧光逐渐减弱，对氧磷浓度与5，7-二甲基香豆素荧光强度值在0.1-200μm范围内呈线性关系，检出限0.039μm。

21、作为优选，碳酸-碳酸钠缓冲溶液为浓度0.2m，ph为10。

22、b.可视化比色/荧光传感器构建：

23、(1)制备多组检测凝胶液：将110体积份铈组装碳点水凝胶磷酸酶浓度20mg/ml、20体积份的碳酸-碳酸钠缓冲溶液、分别加入20体积份不同浓度的对氧磷溶液、并加50体积份二次水，50℃反应30min，得到各组检测凝胶液；

24、(2)利用摄像设备拍照记录每个检测样颜色变化；

25、(3)对步骤2得到中得到的颜色通过imagej图像处理软件分析图片的rgb值，可得到对氧磷浓度与rgb值的线性方程，从而达到可视化比色法检测对氧磷的目的；

26、随着对氧磷浓度的增加，氧化产物4-对硝基苯酚的颜色逐渐加深，b/r逐渐减小，对氧磷浓度与b/r在1-80μm范围内呈线性关系，检出限0.36μm。

27、(4)对步骤(1)中的混合凝胶液中，加入1体积份5，7-二甲基香豆素，混匀，用摄像设备拍照记录其在365nm紫外灯下荧光颜色变化；

28、(5)对步骤(4)得到颜色通过图像处理软件分析，可得到对氧磷浓度浓度与图片平均灰度值的线性方程，从而实现可视化荧光检测对氧磷；

29、随着对氧磷浓度的增加，检测样凝胶的平均灰度值逐渐减弱，对氧磷浓度与平均灰度值在0.1-80μm范围内呈线性关系，检出限0.042μm。

30、作为优选，碳酸-碳酸钠缓冲溶液为浓度0.2m，ph为10。

31、与现有技术相比，本发明有益效果包括：

32、(1)该方法以2-甲基咪唑和1，2，3，4-丁烷四羧酸为源料，通过水热法一步制备碳点，继而以ce3+为催化中心得到铈组装碳点水凝胶磷酸酶，此铈组装碳点水凝胶磷酸酶具有很高的模拟碱性磷酸酶活性，且具有良好的稳定性。

33、(2)本发明制备的铈组装碳点水凝胶磷酸酶分别构建比色/荧光传感器和可视化比色/荧光传感器用于对氧磷的检测，具有便捷、灵敏、和检测线性范围宽的优点。

技术特征：

1.铈组装碳点水凝胶磷酸酶的制备方法，其特征在于：该方法2-甲基咪唑和1，2，3，4-丁烷四羧酸为源料，通过水热法一步制备碳点，继而以ce3+为催化中心得到铈组装碳点水凝胶磷酸酶。

2.根据权利要求1所述的铈组装碳点水凝胶磷酸酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的铈组装碳点水凝胶磷酸酶的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中加入0.0351-0.5259重量份的2-甲基咪唑和0.5重量份的1，2，3，4-丁烷四羧酸；所述步骤s2中加热温度为120～220℃，反应时间为4～24h，滤膜的孔径为0.22μm；所述步骤s3中加入1000体积份碳点水溶液和50-800体积份的硝酸铈溶液。

4.根据权利要求3所述的铈组装碳点水凝胶磷酸酶的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中1，2，3，4-丁烷四羧酸用量为0.3506重量份；所述步骤s2中反应温度为200℃；加热时间为12h；溶剂为丙酮；所述步骤s3中硝酸铈用量为200体积份，其浓度为1m。

5.权利要求1～4任一项所述方法制备的铈组装碳点水凝胶磷酸酶。

6.权利要求1～4任一项所述方法制备的铈组装碳点水凝胶磷酸酶的应用，其特征在于：基于所述铈组装碳点水凝胶磷酸酶构建比色/荧光传感器和可视化比色/荧光传感器，用于对氧磷的检测。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用中基于所述铈组装碳点水凝胶磷酸酶构建比色/荧光传感器的方法包括：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述步骤(1.1)中，在构建比色/荧光传感器，各组分的体积比为：100体积份铈组装碳点水凝胶磷酸酶、200体积份的碳酸-碳酸钠缓冲溶液、20体积份不同浓度的对氧磷溶液、1680体积份二次水5体积份5，7-二甲基香豆素；铈组装碳点水凝胶磷酸酶浓度为1mg/ml；碳酸-碳酸钠缓冲溶液浓度为0.2m且ph＝10；5，7-二甲基香豆素浓度为10mm。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述步骤(2.1)中，在构建可视化比色/荧光传感器，各组分的体积比为：110体积份铈组装碳点水凝胶磷酸酶、20体积份的碳酸-碳酸钠缓冲溶液、20体积份不同浓度的对氧磷溶液、50体积份二次水、1体积份5，7-二甲基香豆素；铈组装碳点水凝胶磷酸酶浓度为20mg/ml；碳酸-碳酸钠缓冲溶液浓度为0.2m且ph＝10；5，7-二甲基香豆素浓度为10mm。

10.根据权利要求7-9任意一项所述的应用，其特征在于：所述步骤(1.3)随着对氧磷浓度的增加，检测液中的氧化产物4-对硝基苯酚在400nm处吸收峰强度逐渐增强，对氧磷浓度与4-对硝基苯酚的吸光度在5-100μm范围内呈线性关系，检出限1.2μm；

技术总结
本发明公开了铈组装碳点水凝胶磷酸酶、其制备方法及在对氧磷检测中的应用，属于光学传感技术领域，该制备方法以2‑甲基咪唑和1，2，3，4‑丁烷四羧酸为源料，通过水热法一步制备碳点，继而以Ce<supgt;3+</supgt;为催化中心得到铈组装碳点水凝胶磷酸酶。本发明制备的铈组装碳点水凝胶磷酸酶具有很高的碱性磷酸酶酶活性，可以催化对氧磷生成黄色的4‑对硝基苯酚，因此可以构建比色传感器，另外4‑对硝基苯酚和5，7‑二甲基香豆素会发生强烈的作用，使其荧光猝灭，从而构建高灵敏检测对氧磷的荧光传感器。因此，本发明还公布了一种基于上述铈组装碳点水凝胶磷酸酶构建比色/荧光传感器和可视化比色/荧光传感器，用于对氧磷的灵敏、宽范围检测应用。

技术研发人员：庄欠粉,易国涛,王勇
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15