水稻OsNrx3基因内含子在转基因植株中提高外源基因表达的应用的制作方法

本发明属于转基因，具体涉及水稻osnrx3基因内含子在转基因植株中提高外源基因表达的应用。

背景技术：

1、内含子是真核生物中只被转录而不被翻译的序列，但内含子并不是无用的序列，其在多个层面对基因表达发挥着调控作用。例如，内含子可以通过可变剪接产生不同的转录本，进而翻译出不同的蛋白质，显著提高蛋白质组的复杂性；内含子的存在还被证明能够保护基因组的完整性(dwyer et al 2021)；此外，全基因组分析表明，内含子数量的增加还会提高mrna的稳定性(narsai et al2007；sharova et al 2009；duan et al 2013)；在内含子剪接过程中会发生无义介导的mrna衰变(nonsense-mediated mrna decay,nmd)，降解含有提前终止密码子的mrna，避免异常蛋白质的产生；同时，一些内含子可以增强基因表达，其中一部分内含子作为转录因子结合位点来增强基因的表达，如内含子中的增强子元件或启动子元件，但也存在一部分内含子虽然不具有转录因子结合位点但仍然能够增强基因表达，这种效应被称为内含子介导的增强作用(intron-mediated enhancement,ime)。

2、通过内含子增强基因的表达不是普遍现象，因为向重组表达盒插入一些内含子未能增强表达。因此并非每一内含子都可以在转基因植物中操纵外源基因或内源基因的基因表达水平。内含子序列内必须存在何种特征性或特异性序列特点以增强给定基因表达在现有技术中是未知的，并且从现有技术中不可能预测给定的植物内含子在使用时是否将产生ime效应。

3、具有ime效应的内含子需要正向位于基因转录区并靠近转录起始位点时才具有显著提高外源基因的表达(callis et al 1987；vasil et al 1989；mun et al2002；parraet al 2011)。首例报道的在植物中发现的ime是callis等人在1987年发现玉米adh1的第一内含子在位于基因的转录区内并靠近5'端时可以显著地提高自身基因和氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,cat)表达，但当该内含子位于非转录区或反方向位于转录区以及位于转录区下游时都不会刺激基因表达(callis et al 1987)。此后，玉米ubi基因的第一内含子(vain et al 1996)、水稻rubi基因5'utr中的内含子(sivamaniand qu 2006)、人类ubc基因5'utr中的内含子(bianchi et al 2013)等越来越多的内含子被发现具有ime效应。

4、具有ime效应的内含子可以提高外源基因在转基因植株中的表达水平，因此在植物基因工程中具有较高的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出水稻osnrx3基因内含子在转基因植株中提高外源基因表达的应用，通过所述内含子提高外源基因在转基因植株中的表达，能够丰富基因工程中调控元件工具的可选性。

2、本发明第一个目的在于，提出水稻osnrx3基因内含子在转基因植株中提高外源基因表达的应用，所述水稻osnrx3基因内含子的核苷酸序列如seq id no:1所示，为水稻osnrx3基因第一内含子。

3、本发明中，所述外源基因可以是任意有特殊性能的目的外源基因，包括但不限于所β-葡糖醛酸酶基因(gus)，萤火虫萤光素酶基因(firefly luciferase,luc)。

4、本发明中，所述植株包括作物、林木、蔬菜、花卉或牧草，优选作物；更优选为水稻。

5、本发明第二个目的在于，提出水稻osnrx3基因内含子、含有所述内含子的表达盒或载体、含有所述内含子的工程菌或转化植物细胞在培育转基因水稻中的应用，所述水稻osnrx3基因内含子的核苷酸序列如seq id no:1所示。

6、本发明第三个目的在于，提供一种增强外源基因表达的方法，步骤包括：

7、将osnrx3基因内含子插入到外源基因转录区5'端；

8、将构建含有外源基因的转化载体导入至植物受体细胞并进行培养；

9、所述水稻osnrx3基因内含子的核苷酸序列如seq id no：1所示。

10、进一步地，上述方法中，所述外源基因为萤火虫萤光素酶基因(fireflyluciferase,luc)。

11、进一步地，上述方法中，所述植物受体细胞选自作物、林木、蔬菜、花卉或牧草，优选作物；更优选为水稻原生质体。

12、进一步地，上述方法中，所述遗传转化载体为puc19-luc、puc19-luc-35s、puc19-luc-intron1-35s、insert 5'、insert m、insert 3'中的一种。

13、本发明第四个目的在于，提出一种增强转基因植株中外源基因表达的方法，利用水稻osnrx3基因内含子序列融合外源基因构建遗传转化载体，通过遗传转化方法将所构建的转化载体导入植物受体中，提高外源基因的表达量；所述水稻osnrx3基因内含子的核苷酸序列如seq id no：1所示。

14、进一步地，上述方法中，所述外源基因为β-葡糖醛酸酶基因(gus)，也可以为其他有特殊性能的目的外源基因。

15、进一步地，上述方法中，所述植物受体细胞选自作物、林木、蔬菜、花卉或牧草，优选作物；更优选为水稻原生质体。

16、进一步地，上述方法中，所述遗传转化载体为pdx2181-35s、pdx2181-35si。

17、进一步地，上述方法中，所述遗传转化法为农杆菌ti质粒介导的遗传转化方法。

18、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

19、本发明提供的水稻osnrx3基因内含子具有ime效应，能够应用于转基因植株显著提高外源基因的表达，丰富了基因工程中调控元件的可选性，在植物基因工程中具有较高的应用价值。

技术特征：

1.水稻osnrx3基因内含子在转基因植株中提高外源基因表达的应用，所述水稻osnrx3基因内含子的核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.水稻osnrx3基因内含子、含有所述内含子的表达盒或载体、含有所述内含子的工程菌或转化植物细胞在培育转基因水稻中的应用，所述水稻osnrx3基因内含子的核苷酸序列如seq id no:1所示。

3.一种增强外源基因表达的方法，其特征在于，步骤包括：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述外源基因为萤火虫萤光素酶基因(firefly luciferase,luc)。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述植物受体细胞为水稻原生质体。

6.一种增强转基因植株中外源基因表达的方法，其特征在于，利用水稻osnrx3基因内含子序列融合外源基因构建遗传转化载体，通过遗传转化方法将所构建的转化载体导入植物受体中，提高外源基因的表达量；所述水稻osnrx3基因内含子的核苷酸序列如seq idno：1所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述外源基因为β-葡萄糖苷酸酶基因。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述植物受体细胞为水稻原生质体。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述遗传转化载体为pdx2181-35s、pdx2181-35si。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述遗传转化法为农杆菌ti质粒介导的遗传转化方法。

技术总结
本发明的目的在于提出水稻OsNrx3基因内含子在转基因植株中提高外源基因表达的应用，通过所述内含子提高外源基因在转基因植株中的表达，能够丰富基因工程中调控元件的可选性，在植物基因工程中具有较高的应用价值。

技术研发人员：周菲,刘萌萌,宫晨波,林拥军,凌飞
受保护的技术使用者：武汉天问生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15