一种昆虫钙调磷酸酶基因的dsRNA及其制备方法和应用

本发明属于生物，涉及蚜虫的防治，特别是指一种昆虫钙调磷酸酶（calcineurin，can）基因的dsrna及其制备方法和应用。

背景技术：

1、随着时代发展，农业生产规模越来越大，但因害虫危害也越发严重，每年造成巨额损失。化学农药因其见效快、成本低、易操作等特点成为防控害虫的主要手段，但长期使用化学农药导致一系列严重问题，如农药残留、害虫产生抗药性、环境污染、影响食品安全、危害天敌等。为解决上述问题，以rna干扰（rnai）为基础的dsrna农药越来越受到重视。昆虫取食dsrna后，会将其分解为21 nt左右的短链rna，可以与靶标基因转录的mrna特异性结合，使其降解，达到沉默靶标基因的目的。现在关于昆虫生理活动非常重要的靶标基因的dsrna用于防治害虫已有不少报道，沉默这类基因以后会导致害虫死亡，且对非靶标生物非常安全。专利cn110484535a公开了6个基于rna干扰技术导致蚜虫若虫和/或成虫期死亡的基因片段，通过将含有dsrna的组合物喷洒到植物上饲喂蚜虫或直接喷洒到蚜虫表面，可以导致蚜虫死亡。但是由于不同种类昆虫对dsrna摄取机制不同，导致其对dsrna的响应和靶基因沉默效率存在差异，因此，不同种类昆虫的致死作用差异较大。然而该专利里公开的喷洒5天后的致死率仅为70%左右，并不能达到农业防治蚜虫的理想效果，亟待进一步提高。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出一种昆虫钙调磷酸酶基因的dsrna及其制备方法和应用，为害虫防治提供了新的防治靶标和应用方法。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种昆虫钙调磷酸酶基因的dsrna，包括如seq id no.2所示的核苷酸序列及与其反向互补的核苷酸序列。如seq id no.2所示的核苷酸序列是根据seq id no.1设计的上游引物seqid no.3和下游引物seq id no.4，通过pcr扩增得到的seq id no.2，其含有t7启动子，片段长度428 bp。用于合成dsrna。

4、上述的昆虫钙调磷酸酶基因的dsrna的制备方法，步骤为：根据昆虫钙调磷酸酶基因设计上游引物和下游引物，以棉蚜cdna为模板，经pcr获得dsrna。

5、上述昆虫钙调磷酸酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，该序列是对已公布的棉蚜基因组数据进行检索和对比，进一步通过pcr克隆获得1578 bp长度的开放阅读框序列。

6、上述上游引物序列如seq id no.5所示、下游引物序列如seq id no.6所示。

7、一种编码上述的dsrna的基因，为昆虫钙调磷酸酶基因，其核苷酸序列如seq idno.1所示。

8、一种含有上述的基因的重组载体。

9、一种含有上述的基因的工程菌。

10、上述的昆虫钙调磷酸酶基因的dsrna或上述的基因或上述的重组载体或上述的工程菌在制备防治蚜虫试剂、降低蚜虫存活率试剂或者抑制昆虫钙调磷酸酶基因表达的试剂中的应用。

11、上述的应用步骤为：饲喂蚜虫含有所述的dsrna的饲料≤48 h，完成杀虫周期。

12、由于本申请的棉蚜can基因与玉米蚜、高粱蚜、桃蚜和豌豆蚜同源性很高，该干扰序列可用于同类群蚜虫中该基因的干扰和防治。

13、进一步的，所述蚜虫为1日龄棉蚜、玉米蚜、高粱蚜、桃蚜和豌豆蚜中的任一种；饲料中dsrna的浓度为200-600 ng/μl；所述dsrna包括由上述的基因或上述的重组载体或上述的工程菌合成的dsrna。

14、本发明具有以下有益效果：

15、1、本发明通过对棉蚜基因组检索，得到棉蚜can基因，经过克隆和测序确定其基因序列为seq id no.1；选择该基因序列为seq id no.2的片段用于合成dsrna。饲喂棉蚜1日龄成虫dscan 24 h后，绝大部分蚜虫死亡，蚜虫取食终浓度为400 和600 ng/μl的dscan 48h以后，其死亡率分别为81.67和93.33%；且杀虫效率显著高于防治棉蚜的常用杀虫剂啶虫脒，为基于rna干扰的害虫防治提供新的防治靶标。

16、2、钙调磷酸酶在棉蚜生长发育和生理活动中十分重要 ，可以影响棉蚜细胞钙离子平衡以及调控免疫反应等。利用dscan干扰can基因的表达后，可以引起棉蚜体内钙离子失衡，或者抑制免疫反应，进而导致棉蚜死亡。相较于防治棉蚜的传统杀虫剂，dscan具有使用剂量小，对环境和非把表生物污染小的特点，是一种安全有效的新型杀虫剂。

技术特征：

1.一种昆虫钙调磷酸酶基因的dsrna，其特征在于：包括如seq id no.2所示的核苷酸序列及与其反向互补的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的昆虫钙调磷酸酶基因的dsrna的制备方法，其特征在于，步骤为：根据昆虫钙调磷酸酶基因设计上游引物和下游引物，以棉蚜cdna为模板，经pcr获得dsrna。

3.根据权利要求2所述的昆虫钙调磷酸酶基因的dsrna的制备方法，其特征在于：所述昆虫钙调磷酸酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4.根据权利要求3所述的昆虫钙调磷酸酶基因的dsrna的制备方法，其特征在于：所述上游引物序列如seq id no.5所示、下游引物序列如seq id no.6所示。

5.一种编码权利要求1所述的dsrna的基因，为昆虫钙调磷酸酶基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

6.一种含有权利要求5所述的基因的重组载体。

7.一种含有权利要求5所述的基因的工程菌。

8.权利要求1所述的昆虫的dsrna或权利要求5所述的基因或权利要求6所述的重组载体或权利要求7所述的工程菌在制备防治蚜虫试剂、降低蚜虫存活率试剂或者抑制昆虫钙调磷酸酶基因表达的试剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤为：饲喂蚜虫含有权利要求1所述的dsrna的饲料≤48 h，完成杀虫周期。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述蚜虫为1日龄棉蚜、玉米蚜、高粱蚜、桃蚜和豌豆蚜中的任一种；饲料中dsrna的浓度为200-600 ng/μl；所述dsrna包括由权利要求5所述的基因或权利要求6所述的重组载体或权利要求7所述的工程菌合成的dsrna。

技术总结
本发明属于生物技术领域，涉及蚜虫的防治，特别是指一种昆虫钙调磷酸酶基因的dsRNA及其制备方法和应用。通过对棉蚜基因组检索，得到棉蚜CaN基因，经过克隆和测序确定其基因序列为SEQ ID NO.1；选择该基因序列为SEQ ID NO.2的片段用于合成dsRNA。饲喂棉蚜1日龄成虫dsCaN 48 h后，83.33%的蚜虫死亡，且杀虫效率显著高于防治棉蚜的常用杀虫剂啶虫脒(41.67%)。本发明为基于RNA干扰的蚜虫的防治提供新的防治靶标。

技术研发人员：安世恒,魏纪珍,李舜佳,孙成贤,姚雪,尹新明
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16