一种促进肺上皮细胞自组装成球的方法

本发明具体涉及一种促进肺上皮细胞自组装成球的方法。

背景技术：

1、体外培养细胞、诱导其成球形成3d结构是组织工程学的前沿技术和研究热点，在发育和疾病研究、药物筛选以及再生医学领域具有巨大潜力和优势。传统的2d细胞培养和动物模型，因为与人的组织器官在结构和功能上存在较大的差别，很难真实地模拟出人体组织器官生理和病理特征，药物研发也一直存在研发投入大、失败率高、创新药少等诸多问题(brigden g,du cros p,wong s.barriers to new drug development in respiratorydisease.eur respir j.2016jan；47(1):356-7.)。体外3d细胞培养，其结构更接近体内真实情况，更能有效模拟细胞间微环境，临床相关性高，已在肿瘤增殖、耐药评估等方面显示出极大前景，因此越来越受基础医学和临床研究者青睐。

2、目前，体外构建3d细胞结构的主要方法是使用细胞外基质(ecm)或人工合成生物材料进行外源性诱导(wang h,feng z,xu b.intercellular instructed-assemblymimics protein dynamics to induce cell spheroids.j am chem soc.2019；141(18):7271-7274.)，其技术门槛高、过程复杂且成本高，不利于该技术的推广应用，因此研发一种简便、经济和有效的体外诱导细胞形成3d组织结构的培养方法非常具有实用价值。

3、h441细胞是一种肺腺癌上皮细胞，是肺部疾病转化应用研究的重要细胞细胞系，但是其在体外培养的生长模式是2d，不能形成3d的上皮组织结构，并且其体外培养依赖matrigel及各种复杂生长因子，成本高。对于如何快速、有效、低成本的使之自组装成球形成3d细胞结构，应用于肺部疾病的研究是目前面临的巨大挑战。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种促进肺上皮细胞自组装成球的方法，它包括如下步骤：

2、1)取传代培养至汇合度40-50％的肺部细胞，加胰酶消化，收集细胞培养12～24h，转染klf5 sirna；

3、2)取步骤1)转染后的细胞培养12-24h，去掉培养基，清洗后加胰酶消化，收集细胞于铺设有玻璃爬片的孔板上培养24-48h，即得。

4、进一步地，所述肺部细胞包括h441细胞；所述klf5 sirna的核苷酸序列如seq idno.1～2所示。

5、进一步地，所述培养是细胞用培养基重悬的细胞悬液于孔板中贴壁培养。

6、更进一步地，所述贴壁培养的温度为37℃，湿度为95％，co2浓度为5％。

7、更进一步地，所述孔板每孔1ml细胞悬液。

8、更进一步地，所述培养基为含10％胎牛血清的1640培养基。

9、进一步地，步骤1)所述胰酶的加入量为0.5～1.5ml，优选1ml；所述消化时间1～2min；步骤2)所述胰酶的加入量为0.25～0.75ml，优选0.5ml；所述消化时间1～2min。

10、更进一步地，所述胰酶的浓度为0.2～0.5％，优选0.25％。

11、本发明还提供了一种3d结构细胞，它是按照前述方法自组装而成。

12、本发明最后提供了一种前述3d结构细胞在制备肺部疾病研究、药物筛选和/或再生医学的模型工具中的应用。

13、本发明一种促进肺上皮细胞自组装成球的方法，将被调控了转录因子klf5的基因表达水平的h441细胞，用胰酶消化处理使之能自组装成球，与目前肺体外3d细胞培养(类器官培养)方法相比，具有以下特点和优势：

14、1)经济、简便。因不需要细胞外基质(ecm)、人工合成材料等外源性信号诱导或支撑塑形，本发明无matrigel多种复杂细胞因子等的相互作用，采取的是常规体外细胞贴壁培养方式和标准化sirna处理，整体流程简便，易于掌握，且成本低。

15、2)快速。主流方法由于流程复杂，一般需要至少一周以上时间才能形成3d球体，本发明方法简便快捷，4天左右即可获得3d球体；

16、3)有效。本发明在klf5基因表达被抑制后，单个细胞形成极强极性，当细胞聚集依赖于细胞间连接的空心球体结构形成，接近体内肺上皮细胞生长模式和微环境。

17、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

18、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种促进肺上皮细胞自组装成球的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述肺部细胞包括h441细胞；所述klf5sirna的核苷酸序列如seq id no.1～2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养是细胞用培养基重悬的细胞悬液于孔板中贴壁培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述贴壁培养的温度为37℃，湿度为95％，co2浓度为5％。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述孔板每孔1ml细胞悬液。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述培养基为含10％胎牛血清的1640培养基。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述胰酶的加入量为0.5～1.5ml，优选1ml；所述消化时间1～2min；步骤2)所述胰酶的加入量为0.25～0.75ml，优选0.5ml；所述消化时间1～2min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述胰酶的浓度为0.2～0.5％，优选0.25％。

9.一种3d结构细胞，其特征在于：它是按照权利要求1～8任一项所述方法自组装而成。

10.权利要求9所述3d结构细胞在制备肺部疾病研究、药物筛选和/或再生医学的模型工具中的应用。

技术总结
本发明公开了一种促进肺上皮细胞自组装成球的方法，它包括如下步骤：1)取传代培养至汇合度40‑50％的肺部细胞，加胰酶消化，收集细胞培养12～24h，转染KLF5SiRNA；2)取步骤1)转染后的细胞培养12‑24h，去掉培养基，清洗后加胰酶消化，收集细胞于铺设有玻璃爬片的孔板上培养24‑48h，即得。本发明方法具备简单易操作，成本低、快速、有效的特点。

技术研发人员：万华靖,罗凤鸣,廖勇
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25