制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用

本发明涉及遗传工程领域中制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用。

背景技术：

1、骨关节炎（osteoarthritis，oa）是一种以关节软骨破坏和持续性疼痛为特征的慢性退行性疾病，伴有结构和功能损伤，其发病率高，病程长，且患病率呈上升趋势。目前，治疗骨关节炎的药物主要以缓解症状为主，到中晚期的患者需进行关节置换手术才能缓解疼痛。以往研究表明，骨关节炎的发生和发展与创伤、代谢、炎症等多种因素有关，这些因素相互作用，导致大多数治疗方法的疗效较差。因此，迫切需要研发新的治疗策略来延缓骨关节炎的进展。

2、近年来，干细胞在治疗骨关节炎中得到了研究。但因干细胞具有组织异质性及其作用机制尚不明确，其治疗骨关节炎的疗效还有待提高。软骨祖细胞被认为是骨骼中具有软骨生成潜能和高复制能力的组织特异性干细胞，近年来研究表明，软骨祖细胞在软骨再生修复应用中有很大的优势，有助于骨的发育、稳态、衰老和再生。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种能够治疗骨关节炎的细胞制品。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种制备重组软骨祖细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

4、1）分离软骨祖细胞：酶解消化离体的关节透明软骨得到酶解物，利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物得到软骨祖细胞；

5、2）向所述软骨祖细胞中导入肿瘤坏死因子α诱导蛋白3的编码基因，得到所述重组软骨祖细胞。

6、进一步地，上述方法中所述重组软骨祖细胞表达tnfaip3蛋白质。

7、所述肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tnf alpha induced protein 3，tnfaip3)为下述任一种蛋白质，

8、a1）氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质；

9、a2）将seq id no.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1）所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

10、a3）在a1）或a2）的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

11、所述tnfaip3蛋白质的编码基因是编码序列是seq id no.2的cdna分子或dna分子。

12、进一步地，上述方法中所述方法不包括软骨细胞的去分化。

13、进一步地，上述方法中利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物包括利用培养贴壁细胞的培养基进行培养的步骤。

14、上文中所述培养贴壁细胞的培养基可含有体积百分数为10%的fbs（胎牛血清）。

15、上文中所述培养贴壁细胞的培养基可为向α-mem培养基中添加fbs、青霉素和链霉素得到的液体培养基（完全培养基），所述培养贴壁细胞的培养基中fbs的体积百分数为10%，青霉素的含量可为100单位/ml，链霉素的含量可为100ng/ml。

16、进一步地，上述方法中所述关节透明软骨来源于人，具体来源于人的膝关节。

17、进一步地，上述方法中所述酶解消化用胶原酶进行。

18、上文中所述胶原酶可为ⅱ型胶原酶。

19、上文中所述酶解消化可在ⅱ型胶原酶的含量可为125 cdu/ml的酶解反应体系中，37℃消化2小时。

20、进一步地，上述方法中所述软骨祖细胞具有通过分泌作用抑制破骨细胞的形成和/或骨吸收的能力。

21、本发明还提供了一种重组软骨祖细胞，所述重组软骨祖细胞由前述方法制备。该重组软骨祖细胞表达氨基酸是seq id no.1的蛋白质。

22、本发明还提供了一种治疗和/或预防和/或缓解和/或改善骨关节炎的药物，所述药物由药用辅料和前述的重组软骨祖细胞组成。

23、进一步地，上述药物的剂型为注射剂。

24、本发明通过实验证明，tnfaip3基因修饰人软骨祖细胞可以有效减轻骨关节炎的病理损害，同时可抑制软骨下成骨细胞发生坏死性凋亡，对创伤性骨关节炎具有保护作用。

技术特征：

1.制备重组软骨祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组软骨祖细胞表达所述肿瘤坏死因子α诱导蛋白3。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法不包括软骨细胞的去分化。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物包括利用培养贴壁细胞的培养基进行培养的步骤。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述关节透明软骨来源于人。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述酶解消化用胶原酶进行。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述软骨祖细胞具有通过分泌作用抑制破骨细胞的形成和/或骨吸收的能力。

8.重组软骨祖细胞，其特征在于，所述重组软骨祖细胞由权利要求1-6中任一项所述方法制备。

9.治疗和/或预防和/或缓解和/或改善骨关节炎的药物，其特征在于，所述药物由药用辅料和权利要求8所述的重组软骨祖细胞组成。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。

技术总结
本发明公开了遗传工程领域中制备重组软骨祖细胞的方法及获得的重组软骨祖细胞与应用。本发明所要解决的技术问题是如何提供一种能够治疗骨关节炎的细胞制品。为了解决该技术问题，本发明提供了制备重组软骨祖细胞的方法，所述方法包括如下步骤：1）分离软骨祖细胞：酶解消化离体的关节透明软骨得到酶解物，利用软骨祖细胞的迁移特性培养所述酶解物得到软骨祖细胞；2）向所述软骨祖细胞中导入TNFAIP3蛋白质的编码基因，得到所述重组软骨祖细胞。本发明可用于治疗和/或预防和/或缓解和/或改善骨关节炎。

技术研发人员：朱恒,李晓彤,李志凌,李佩霖,王飞燕,张晓宇,尹博丰,郝瑞聪,汤杰,张文静,赵世荣
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15