检测肿瘤组织中抗原WT1表达水平的引物、探针和方法与流程

本发明属于生物医药，更具体地，本发明涉及一种检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的引物、探针和方法。

背景技术：

1、wt1(wilm's tumor gene)是最早发现与wilm's肿瘤发生、发展有关的基因，具有激活和抑制双重功能的转录调控蛋白。科学家发现该基因在白血病以及各种实体肿瘤包括肺癌和乳腺癌中高表达，且在这些恶性肿瘤中起癌基因作用。这提示wt1蛋白可以作为一个新的超表达的肿瘤抗原。

2、癌症是目前威胁人类健康的重大疾病之一，传统治疗癌症的三大主要手段：放疗、化疗、手术，都存在一定的副作用和不足，很难真正治愈癌症。因此，很多科学家开始研究靶向治疗、肿瘤免疫治疗的方法。目前众多的药物治疗中，包括肿瘤疫苗、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell,car-t)、抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate，adc)等都以wt1作为靶点。若是有检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的方法，可以帮助患者找到适合对应靶点的药物，从而实现更好的治疗效果。

3、石蜡包埋后进行病理检测是临床常见的操作，患者石蜡保存的样本(formalin-fixed and parrffin-embedded,ffpe)容易获取，且保存时间长，是检测muc1表达水平的理想肿瘤样品。但是ffpe保存的样品mrna质量非常差，这就为精准检测wt1表达水平带来不便。因此，提供一种可以精准检测ffpe保存的样品中wt1抗原表达水平的方法非常有意义。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的引物、探针、试剂盒和方法。

2、实现上述发明目的的技术方案包括如下。

3、本发明的第一方面，提供了一种检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的引物，包括如seq id no.1所示的正向引物和如seq id no.2所示的反向引物。

4、本发明的第二方面，提供了一种检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的探针，所述探针的序列如seq id no.3所示。

5、本发明第三方面，提供了一种检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的试剂盒，包括上述引物和探针。

6、本发明的第四方面，提供了一种石蜡包埋肿瘤组织样品的前处理方法，包括以下步骤：使用上述引物，对石蜡包埋肿瘤组织样品的cdna进行预扩增。

7、本发明的第五方面，提供了一种检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的方法，包括以下步骤：采用上述前处理方法对待测样品进行处理后，再进行qpcr扩增。

8、在本发明中，首先针对肿瘤相关抗原wt1和内参基因hprt1设计了特异性高、敏感性强的引物和探针，并对肿瘤相关抗原wt1的检测方法进行了全面优化；在此构思下，实现了mrna保存状况较差的石蜡包埋肿瘤组织样品中wt1表达水平的精准检测，操作简单，结果准确，重复性好、灵敏度高、特异性好，具有广阔的临床应用前景。

技术特征：

1.一种检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的引物，其特征在于，包括如seq id no.1所示的正向引物和如seq id no.2所示的反向引物。

2.根据权利要求1所述的检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的引物，其特征在于，还包括检测内参基因hprt1的如seq id no.4所示的正向引物和如seq id no.5所示的反向引物。

3.一种检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的探针，其特征在于，所述探针的序列如seqid no.3所示。

4.根据权利要求3所述的检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的探针，其特征在于，所述探针的5'修饰有fam，3'修饰有bhq1。

5.根据权利要求3或4所述的检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的探针，还包括检测内参基因hprt1的如seq id no.6所示的探针。

6.根据权利要求5所述的检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的探针，所述探针的5'修饰有hex，3'修饰有bhq1。

7.一种检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物、和权利要求3～6任一项所述的探针。

8.根据权利要求7所述的检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的试剂盒，其特征在于，所述引物的工作浓度为200nm～300nm，所述探针的工作浓度为100nm～200nm。

9.一种石蜡包埋肿瘤组织样品的前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：对石蜡包埋肿瘤组织样品的cdna进行预扩增，所述预扩增的反应体系为：preamp master mix 10μl、cdna 100ng、引物混合物4μl、rnase-free ddh2o至20μl；所述预扩增的反应程序为：95℃10min；95℃15s、60℃4min，14cycles；99℃10min；所述引物混合物中的引物包括如seq idno.1所示的正向引物和如seq id no.2所示的反向引物、以及如seq id no.4所示的正向引物和如seq id no.5所示的反向引物。

10.一种检测肿瘤组织中抗原wt1表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求9的前处理方法对待测样品进行处理后，再进行qpcr扩增。

技术总结
本发明公开了一种检测肿瘤组织中抗原WT1表达水平的引物、探针和方法，所述引物包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示。在本发明中，首先针对肿瘤相关抗原WT1和内参基因HPRT1设计了特异性高、敏感性强的引物和探针，并对肿瘤相关抗原WT1的检测方法进行了全面优化；在此构思下，实现了mRNA保存状况较差的石蜡包埋肿瘤组织样品中WT1表达水平的精准检测，具有广阔的临床应用前景。

技术研发人员：潘有东,马璐,卫静,车令君,张梦雅,欧黄思,赵钊,王弈,万季
受保护的技术使用者：北京新合睿恩生物医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16