DENV-2全长感染性克隆及其构建方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种denv-2全长感染性克隆及其构建方法和应用。

背景技术：

1、登革病毒(dengue virus)属于黄病毒科黄病毒属中的一个血清型亚群，形态结构与乙脑病毒相似，但体积较小，约17～25nm，依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型，同一型中不同毒株也有抗原差异。其中2型传播最广泛，各型病毒间抗原性有交叉，与乙脑病毒和西尼罗病毒也有部分抗原相同。病毒在蚊体内以及白纹伊蚊传代细胞、猴肾、地鼠肾原代和传代细胞中能增殖，并产生明显的细胞病变。

2、反向遗传操作技术的基本过程是先获得病毒的全基因组，将其组装至适宜载体上，将构建好的全长质粒通过转染至易感细胞，进而拯救出具有感染性的病毒。反向遗传学技术是开展病毒研究的一个有效的平台，可通过操纵基因组的变化，从而影响相应的表观变化，以此判断这些操作对病毒的影响。构建新型2型登革病毒sz38株的全长感染性克隆，以此为基础可以对2型登革病毒sz38株的毒力、跨种传播机制等开展研究，同样也可对相关疫苗的研究提供一个有用的平台，但是目前尚未有相关研究和报道。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供一种高效稳定的denv-2全长感染性克隆的构建方法。

2、一种denv-2全长感染性克隆的构建方法，包括如下步骤：

3、提供细菌人工染色体载体和denv2 sz38株病毒的基因组cdna，所述细菌人工染色体载体含有cmv启动子序列、核酶序列和牛生长激素终止与聚腺苷酸化信号序列；

4、以所述基因组cdna和所述细菌人工染色体载体为模板，用第一引物对和第二引物对通过重叠pcr扩增将cmv启动子序列引入到denv基因组5′端得到片段s1；所述第一引物对和所述第二引物对的核苷酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq idno:4所示；

5、以所述基因组cdna和所述细菌人工染色体载体为模板，用第三引物对和第四引物对通过重叠pcr扩增将核酶序列和牛生长激素终止与聚腺苷酸化信号序列引入到denv基因组3′端得到片段s4；所述第三引物对和所述第四引物对的核苷酸序列分别如seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示；

6、以所述基因组cdna为模板，分别用第五引物对和第六引物对通过pcr扩增得到片段s2和片段s3；所述第五引物对和所述第六引物对的核苷酸序列分别如seq id no:9、seqid no:10、seq id no:11和seq id no:12所示；

7、通过双酶切和同源重组将所述片段s1、片段s2、片段s3和片段s4插入至所述细菌人工染色体载体中，得到denv-2全长感染性克隆。

8、在一些实施例中，所述基因组cdna的制备方法包括以下步骤：将denv2 sz38株病毒感染细胞，并培养48小时以上，收集上清，提取病毒rna，然后反转录得到所述基因组cdna。

9、在一些实施例中，所述双酶切所用到的酶为narⅰ和mluⅰ，以及narⅰ和nheⅰ。

10、本发明还提供了一种denv-2全长感染性克隆，其根据如上所述的构建方法构建得到。

11、在一些实施例中，其核苷酸序列如seq id no:13所示。

12、本发明还提供了如上所述的denv-2全长感染性克隆在制备具有遗传稳定性的登革病毒中的应用。

13、在一些实施例中，制备方法包括以下步骤：培养293t细胞至细胞汇合度生长至70％以上时，转染所述denv-2全长感染性克隆；转染5～6小时后，更换为含4％胎牛血清的dmem培养基继续培养70～72h，将细胞培养物在-80～37℃冻融3次以上，离心收取上清得到病毒储存液。

14、本发明还提供了如上所述的denv-2全长感染性克隆在制备抗登革病毒药物中的应用。

15、本发明还提供了如上所述的denv-2全长感染性克隆在制备预防登革病毒的疫苗中的应用。

16、本发明还提供了一种宿主细胞，其含有如上所述的denv-2全长感染性克隆。

17、本发明提供了一种基于细菌人工染色体dna启动的登革病毒感染性克隆的方法，构建所得denv-2全长感染性克隆为pbac-dvsz38，含有：(a)细菌人工染色体载体骨架；(b)2型登革病毒sz38株全长基因组；和(c)位于登革病毒基因组5’端的人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,cmv)早期起启动子序列，以及位于登革病毒基因组3’端的丁型肝炎病毒(hepatitis d virus,hdv)核酶(ribozyme，rz)序列和牛生长激素终止与聚腺苷酸化信号(bovine growth hormone termination and polyadenylation signal，bgh)序列。本发明的构建方法能成功且高效地构建得到denv-2全长感染性克隆，且通过实验证明，该denv-2全长感染性克隆能成功拯救得到子代病毒，并且子代病毒rdenv2与母本野生型病毒wtdenv2具有相同的生长特性，可以用作后续基础与应用研究。

技术特征：

1.一种denv-2全长感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因组cdna的制备方法包括以下步骤：将denv2 sz38株病毒感染细胞，并培养48小时以上，收集上清，提取病毒rna，然后反转录得到所述基因组cdna。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述双酶切所用到的酶为narⅰ和mluⅰ，以及narⅰ和nheⅰ。

4.一种denv-2全长感染性克隆，其特征在于，根据权利要求1～3任一项所述的构建方法构建得到。

5.根据权利要求4所述的denv-2全长感染性克隆，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno:13所示。

6.权利要求4或5所述的denv-2全长感染性克隆在制备具有遗传稳定性的登革病毒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，制备方法包括以下步骤：培养293t细胞至细胞汇合度生长至70％以上时，转染所述denv-2全长感染性克隆；转染5～6小时后，更换为含4％胎牛血清的dmem培养基继续培养70～72h，将细胞培养物在-80～37℃冻融3次以上，离心收取上清得到病毒储存液。

8.权利要求4或5所述的denv-2全长感染性克隆在制备抗登革病毒药物中的应用。

9.权利要求4或5所述的denv-2全长感染性克隆在制备预防登革病毒的疫苗中的应用。

10.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求4或5所述的denv-2全长感染性克隆。

技术总结
本发明涉及一种DENV‑2全长感染性克隆及其构建方法和应用。本发明的构建方法能成功且高效地构建得到DENV‑2全长感染性克隆，且通过实验证明，该DENV‑2全长感染性克隆能成功拯救得到子代病毒，并且子代病毒rDENV2与母本野生型病毒wtDENV2具有相同的生长特性，可以用作后续基础与应用研究。

技术研发人员：杜寿文,林吉辉,王宇航,杨桂林,李体远,周伯平,王继刚
受保护的技术使用者：深圳市人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15