一种农杆菌注射剪口芽点的三七遗传转化方法

本发明属于植物基因遗传转化领域，具体涉及一种农杆菌注射剪口芽点的三七遗传转化方法。

背景技术：

1、根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)转化系统是一种天然的基因转化系统，当植物受到伤害后，分泌含有酚类化合物的汁液，这些酚类物质通过染色体毒性基因等介导的趋化性促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面，这时农杆菌质粒中t-dna片段会转移并整合到受体物的基因组中(christie,p.j.agrobacterium and plantcell transformation.encyclopedia of microbiology(third edition),2009,pages 1-16)。根癌农杆菌介导的植物转化法是目前应用最广、转化机理最清楚的遗传转化方法；其操作简便，成本低廉，并可侵染大多数双子叶植物、少数单子叶和裸子植物(张福丽等.农杆菌介导的植物转基因影响因素.生物技术通报,2012(07):14-19)

2、红色荧光蛋白(dsred)来源于珊瑚，是第一个在植物中用做报告基因的珊瑚衍生荧光蛋白(jach,g.,binot,e.,frings,s.,et al.use of red fluorescent protein fromdiscosoma sp.(dsred)as a reporter for plant gene expression.the plantjournal.2001,28(4):483-491)。dsred2是源于野生型dsred的一种人工突变基因，该突变基因的表达产物rfp2，其蛋白结构与绿色荧光蛋白(gfp)相似；与dsred基因编码的rfp蛋白相比，其发光基团的成熟速度更快，形成的难溶性多聚合体也有所减少。dsred2的最大激发波长和发射波长在563nm-582nm之间，其对转化植物的生长或繁育能力没有明显的不利影响，并且可通过荧光显微镜观察转基因植物中dsred2的红色荧光。dsred2作为报告基因，在植物遗传转化实验中可鉴定体系的构建或目的基因的导入，以促进转化体的筛选，但从未用于三七遗传转化。

3、三七[panax notoginseng(burk)f.h.chen]为五加科人参属多年生草本植物，在我国已经有上百年的种植历史，其根茎入药，具有消肿定痛、活血散瘀、止血补血、提高机体免疫力等功效，药用价值极高。三七主要种植在我国云南省文山州，其生长周期长达三年，喜阴湿环境，需在遮阴网下栽培。由于大规模连作以及三七特殊的生长环境，三七病害的种类、发病面积及严重程度呈上升趋势，对三七的产量和质量造成了严重影响，阻碍三七产业的可持续发展。此外，三七的品种选育滞后，缺乏抗性好品质优良稳定的品种。

4、云南三七主产区的病害主要为根腐病、病毒病、灰霉病、疫霉病等。目前关于三七病害的研究仅停留在抗病基因分离和功能验证以及致病机制层面(li,j.b.,bao,y.l.,wang,z.r.,.research progress in diseases of panaxnotoginseng.physiol.mol.plant pathol.2022,121(3):101878)。遗传转化体系是利用转基因和基因编辑等生物育种技术培育具有独特性状新种质和新品种的基础，但由于三七遗传转化体系的缺乏限制了对其深入研究，限制了其遗传育种水平的提升。因此，迫切需要构建针对三七的遗传转化体系，从而有效推进三七的遗传育种研究。

技术实现思路

1、本发明提供了一种农杆菌注射剪口芽点的三七遗传转化方法，以解决上述背景技术中如何进行三七的遗传转化的问题，通过直接在三七的剪口芽点注入携带报告基因的根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)，从而将报告基因整合至三七的基因组中，结合pcr、qrt-pcr及western blot等技术，筛选得到了含有并表达外源基因的转基因三七植株。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、1)三七转基因受体的准备

4、待种植于遮阴网下的一年生三七头年生长的茎叶脱落后，剪口处的新芽萌发未露出土壤时，去除根部表面的土壤使剪口露出，使用0.9％生理盐水清洗剪口，此时一年生三七植株为转基因受体；

5、2)农杆菌的活化

6、将含携带目的基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌液划线接种于含有20mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的lb固体培养基中，于28℃培养48h；刮取菌苔至含有30mg/ml乙酰丁香酮的mgl培养基中，震荡培养(200rpm，28℃)至菌液od600为0.8；

7、所述携带目的基因的植物表达载体按常规方法制备并按常规方法转入根癌农杆菌制得菌液；

8、3)注射法转入目的基因

9、使用注射器吸取步骤2)农杆菌菌液注射至步骤1)剪口的白色芽点中形成浸润圈，注射后覆土，生长25-30天后，筛选获得转基因三七植株。

10、与现有技术相比，本发明的优点和技术效果：

11、1)三七遗传转化体系的缺乏是制约三七功能基因组学研究的瓶颈，本发明将携带报告基因的农杆菌注射至三七剪口的芽点，利用pcr、real time pcr及western blot等技术筛选转基因三七植株，转化率达到85.7％(以pcr筛选的阳性转基因植株计算转化率)，该方法突破了三七中缺乏有效遗传转化体系的屏障，为三七功能基因组学以及遗传育种的研究提供了技术支撑；

12、2)本发明首次针对三七构建了非组培的遗传转化体系，该方法无需复杂的组培工作，对仪器设备要求低，投入成本低，转化周期短，转化效率高。

技术特征：

1.一种农杆菌注射剪口芽点的三七遗传转化方法，其特征在于，步骤如下：

2.根据权利要求1所述的农杆菌注射剪口芽点的三七遗传转化方法，其特征在于：携带目的基因的植物表达载体为含有红色荧光蛋白基因dsred2的表达载体pcambia2300-dsred2。

3.权利要求1所述的农杆菌注射剪口芽点的三七遗传转化方法在三七功能基因组学及遗传育种中的应用。

技术总结
本发明公开了一种农杆菌注射剪口芽点的三七遗传转化方法，该方法经过野生型三七剪口转基因受体的准备；携带目的基因植物表达载体的根瘤农杆菌活化；剪口芽点注射；转基因三七植株培养；筛选并获得转基因三七植株；实验结果显示转基因三七植株的外观与野生型三七没有显著差异，PCR、Real‑time PCR、Western blot、荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜检测结果证明外源基因成功整合到三七的基因组中且稳定表达；本发明建立的三七剪口芽点注射转基因法突破了三七难以遗传转化的屏障，为三七功能基因组学以及遗传育种研究提供了技术支撑。

技术研发人员：刘迪秋,李文云,顾悦,车晓莉,甘昆发
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15