一种酿酒酵母工程菌株及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种酿酒酵母工程菌株及其应用。

背景技术：

1、二氢山奈酚广泛存在于豆类、西兰花、卷心菜、猕猴桃、葡萄、无头甘蓝、草莓、茶叶以及西红柿等植物性食物中，它具有抗氧化、抗菌、抗炎、降脂以及抗癌效应等多种功效，但价格昂贵。二氢山奈酚主要是从植物中分离纯化得到。传统植物化学法提取得到的产物多为二氢山奈酚混合物，下游纯化过程操作繁琐，对环境不友好。此外，由于这些植物中的二氢奈酚含量较低，且其生长的地理位置和气候条件存在差异，使用植物作为生产二氢山奈酚的来源会受制于其缓慢的生长速度和且组成成分并不均一，提取较为困难。。

2、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase,f3h)在黄酮类化合物的生物合成途径中发挥重要作用，其主要功能包括催化柚皮素c环第3位羟基化形成二氢山奈酚(dihydrokaempferol，dhk)。不同植物来源，如茶树(camellia sinensis)、银杏(ginkgobiloba)和大豆(glycine max)、草莓(fragaria x ananassa)、海棠(malus x domestica)等的f3h具有相似的催化特性。相较于传统植物提取法，目前已有使用重组微生物细胞以更少的时间和能量消耗来合成获取二氢山奈酚的研究。例如，将不同植物来源的f3h基因在酿酒酵母中表达后，均可将柚皮素(naringenin，nar)转化为二氢山奈酚。但转化率较低，有待进一步提升。因此通过基因工程和代谢工程的手段改造酵母菌株以提高二氢山奈酚的产量及产率，具有重要的意义和实际的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供能够显著提升将柚皮素转化为二氢山奈酚效率的酵母工程菌及其构建方法，解决现有酿酒酵母不能以柚皮素为底物，合成二氢山奈酚，及合成转化率低下的不足。通过发掘有效的长链非编码rna(lncrna)靶点，来提升酿酒酵母对柚皮素的转化能力，从而提高二氢山奈酚的产量及产率。本发明对表达f3h酿酒酵母的关键lncrna靶点进行敲除，提升酵母细胞的柚皮素转化效率，克服了现有技术的缺陷，实现了二氢山奈酚合成能力的大幅提升。

2、本发明的目的通过下述技术方案实现：

3、一种酿酒酵母工程菌株，具有如下特点：lncrna sut067、lncrna sut433和lncrnacut782中的至少一种缺失或突变；且含有能表达黄烷酮-3-羟化酶的编码核酸。

4、所述的酿酒酵母工程菌株的出发菌株优选为具有cen.pk背景的菌株，该菌株是常用的酵母菌株，在工业界和学术界的代谢工程和系统生物学研究广泛应用(microb cellfact,2012,11,36)，代表性及普适性较好；优选为酿酒酵母cen.pk 113-5d。

5、所述的缺失优选通过同源重组的方法或crispr/cas9基因编辑技术进行无痕敲除。

6、所述的突变是使得相应的lncrna不再发挥功能，可通过同源重组的方法或crispr/cas9基因编辑技术得到。

7、所述的黄烷酮-3-羟化酶是植物来源的黄烷酮-3-羟化酶；优选为草莓黄烷酮-3-羟化酶和海棠黄烷酮-3-羟化酶。

8、所述的能表达黄烷酮-3-羟化酶的编码核酸，优选通过如下步骤得到：依据黄烷酮-3-羟化酶的氨基酸序列，进行适合酿酒酵母表达的密码子优化，将优化得到的编码黄烷酮-3-羟化酶的核酸克隆至表达载体中，得到能表达黄烷酮-3-羟化酶的编码核酸。

9、所述的黄烷酮-3-羟化酶为草莓黄烷酮-3-羟化酶时，优化的核酸序列优选如seqid no.1所示。

10、所述的黄烷酮-3-羟化酶为海棠黄烷酮-3-羟化酶时，优化的核酸序列优选如seqid no.2所示。

11、所述的表达载体优选为p416gpd、p416tef、p416adh、p416cyc1、p426gpd、p426tef、p426adh或p426cyc1。

12、所述的酿酒酵母工程菌株对柚皮素的转化效率高，从而其可用于制备二氢山奈酚。

13、一种二氢山奈酚的制备方法，包括如下步骤：

14、1)将上述酿酒酵母工程菌株接种于发酵培养基培养；

15、2)接着加入底物柚皮素，继续发酵培养，收集发酵产物即可得到二氢山奈酚。

16、步骤1)中所述的发酵培养基优选为ypd培养基。

17、步骤1)中所述的培养的条件优选为于28～32℃、150～250rpm培养20～30h；更优选为于30℃、200rpm培养24h。

18、步骤2)中所述的柚皮素的加入量优选按150～300mg/l计；更优选按200mg/l计。

19、步骤2)中所述的发酵培养的条件优选为于28～32℃、150～250rpm培养80～120h；更优选为于30℃、200rpm培养96h。

20、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

21、本发明对表达黄烷酮-3-羟化酶酵母工程菌进行了针对lncrna靶点的改造，构建得到高产二氢山奈酚的工程菌对底物柚皮素转化率显著提升，均超过50.2％。其中，q3m菌株转化率可达75.9％，相比对照菌株q0m二氢山奈酚的产量提高了50％以上。不同于提高重组f3h表达质粒拷贝数等传统方法，该酵母工程菌仅从出发菌底盘细胞自身出发，围绕lncrna相关靶点的敲除而展开。创新性地改造长非编码rna靶点，有效的解决了酿酒酵母表达黄烷酮-3-羟化酶对底物转化率不高的首要问题。酵母工程菌用于提高其他高经济价值植物外源酶有较强的潜力，具备广阔的应用前景和重要的实践意义。

技术特征：

1.一种酿酒酵母工程菌株，其特征在于具有如下特点：lncrna sut067、lncrna sut433和lncrna cut782中的至少一种缺失或突变；且含有能表达黄烷酮-3-羟化酶的编码核酸。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述的酿酒酵母工程菌株的出发菌株为具有cen.pk背景的菌株。

3.根据权利要求2所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述的酿酒酵母工程菌株的出发菌株为酿酒酵母cen.pk 113-5d。

4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述的黄烷酮-3-羟化酶为草莓黄烷酮-3-羟化酶或海棠黄烷酮-3-羟化酶。

5.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述的能表达黄烷酮-3-羟化酶的编码核酸通过如下步骤得到：依据黄烷酮-3-羟化酶的氨基酸序列，进行适合酿酒酵母表达的密码子优化，将优化得到的编码黄烷酮-3-羟化酶的核酸克隆至表达载体中，得到能表达黄烷酮-3-羟化酶的编码核酸。

6.根据权利要求5所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：

7.根据权利要求5所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：

8.权利要求1～7任一项所述的酿酒酵母工程菌株在制备二氢山奈酚中的应用。

9.一种二氢山奈酚的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的二氢山奈酚的制备方法，其特征在于：

技术总结
本发明公开了一种酿酒酵母工程菌株及其应用。该酿酒酵母工程菌株具有如下特点：LncRNA SUT067、LncRNA SUT433和LncRNA CUT782中的至少一种缺失或突变；且含有能表达黄烷酮‑3‑羟化酶的编码核酸。本发明的酵母基因工程菌皆可有效提高DHK的产量。不同于直接提高黄烷酮3‑羟化酶拷贝数等传统方法，该酵母基因工程菌从底盘细胞自身出发，以关键LncRNA相关靶点为抓手而展开，创新性地改造长非编码RNA靶点，有效的解决了酿酒酵母表达植物来源的酶对底物转化率不高的首要问题。本发明构建的酵母工程菌用于合成二氢山奈酚具有较强的潜力，具备广阔的应用前景和重要的实践意义。

技术研发人员：黄明涛,秦岭,潘雨阳,薛松绿
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22