间性猪WNT2B基因的CNV标记及应用

本发明属于分子遗传育种技术以及分子诊断领域，具体是间性猪wnt2b基因的cnv标记及应用。

背景技术：

1、间性猪中的38，xx-dsd，sry阴性(38,xx disorder of sex development，sry-)猪是指染色体核型为38，xx的猪在性别发育过程中出现异常，导致性腺表型和外生殖器的性别特征不一致。具体而言，38，xx-dsd猪在没有y染色体的情况下，仍能形成睾丸或者卵睾体，这种性别发育异常研究对于探讨猪的性别决定、分化机制以及开展基因诊断具有重要科学意义和实践意义。在正常情况下，公母猪的性别决定是雄异配型，取决于y染色体上的性别决定基因(如sry基因)，但38，xx-dsd猪的存在表明还可能存在其他常染色体上的基因部分替代了sry基因的功能或者影响了性别相关基因的调控，深入探索这些潜在的基因和调控网络，以及它们在性别发育中的作用，可以进一步揭示猪性别发育的相关基因以及其调控元件，为猪的遗传改良和基因诊断提供有益的信息。此外，猪作为人类的性别发育异常的动物模型，通过比较猪和人类的性别发育异常的机制，有助于理解和解决人类性别发育异常，从而更好开展基因诊断和基因治疗。然而间性病是一类复杂的疾病，其致病原因涉及多种因素，包括遗传突变、染色体异常、激素信号通路紊乱等。由于其多因素的性质，目前对性别发育障碍的致病机制了解还有限，仍需进一步研究。

2、拷贝数变异(copy number variation，cnv)为基因组中某个特定区域的拷贝数在个体或种群之间发生变异的现象，其与单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,snp)相比，cnv涉及更大的基因组片段，它可以涉及一个或多个基因，cnv在人类和其他物种中很常见，它可以是天然的遗传变异，也可通过突变、基因重排或染色体重组等机制产生，其在人类遗传学和疾病研究中起着重要作用，通常与遗传性疾病和多种复杂疾病的发生风险相关。拷贝数变异可以影响基因的表达水平和调控功能，从而对个体的生理、发育和疾病易感性产生极大的影响，对其的深入研究利于理解遗传变异的作用和疾病的发生机制具有重要意义。

3、wnt2b基因(wingless-type mmtv integration site family member 2b)是wnt家族的一员，是经典wnt/β-catenin通路的配体和激活剂。研究表明wnt2b基因参与泌尿生殖系统的形成。此外，wnt4基因也在这两个途径中发挥作用，在哺乳动物胚胎期与卵巢发育中扮演重要角色。值得注意的是，wnt/β-catenin信号还参与睾丸减数分裂前未分化精原细胞的扩增。然而，至今为止，尚未见到关于wnt2b基因遗传变异与间性猪相关研究的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供间性猪wnt2b基因的cnv标记及应用，筛选出与猪性别发育异常性状相关的cnv分子标记，提供一个与38，xx-dsd猪的关键致病基因相关的cnv标记。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：间性猪wnt2b基因的cnv标记，标记位于wnt2b基因参考基因组序列nc_010454.4的chr-4:107914901-107923000。

3、本发明是通过检测cnv标记来对间性猪进行致病原因的分类，具有广泛的应用前景，特别是在进一步验证wnt2b基因cnv的功能方面，并有望用于疾病检测、畜禽性别控制技术以及疾病治疗相关领域等多个方面。为了实现高准确性的基因组突变检测，本发明采用了10×genomics de novo测序技术，并达到60×的测序深度，从而实现了99％以上的基因组覆盖率。这样的深度测序能够更准确地发现导致38，xx-dsd猪性别发育异常的致病基因。本发明还采用了atac-seq和rna-seq技术，从染色质可及性和转录本的表达量的角度印证wnt2b基因cnv的可靠性。

4、进一步的，cnv的内参基因为具有两个拷贝的β肌动蛋白基因(actin beta，actb)、两个拷贝的x型胶原α1链基因(collagen type x alpha 1chain，col10a1)和两个拷贝的胰高血糖素基因(glucagon，gcg)。利用cnvplex检测试剂盒检测候选cnv在38，xx-dsd群体中的分布，并设计cnv的验证引物。

5、进一步的，cnv标记的引物为：

6、wnt2b_1-f:aggggaaaggtttggcattcag；

7、wnt2b_1-r:accttggagaggttcctttccct；

8、wnt2b_2-f:aagtaggggttggactggagctg；

9、wnt2b_2-r:atgggaatgaacaaggggtgaat；

10、内参基因的引物为：

11、actb-f:cggtttcagcgccttgagaa；

12、actb-r:gtggccctcaggtgatcagagt；

13、col10a1-f:ggaatcctgagaaagaggagtgga；

14、col10a1-r:cgtactcagaggagtacagcccgt；

15、gcg-f:gcctggagtccagatacttgctgt；

16、gcg-r:agtcactggtaaacgtgccctgt。

17、进一步的，同时选择对1月龄的正常母猪(38，xx)和38，xx-dsd，sry阴性猪，猪龄均为1月龄，同时利用性腺组织的atac-seq和rna-seq的bw文件在igv(integrative genomicsviewer)软件对两者进行关联分析，查看wnt2b基因的染色质可及性和转录本的表达量。

18、间性猪wnt2b基因的cnv标记的应用，所述的间性猪wnt2b基因的cnv标记用于种猪选育，有效筛除有害个体，进行性别控制，在38，xx-dsd猪的性别发育异常研究中具有重要作用。

19、本发明的有益效果是：本发明以猪wnt2b基因参考基因组序列的chr-4:107914901-107923000为cnv标记，利用特定的引物对，采用qpcr技术扩增cnv区域以及内参基因，检测该标记在猪群体中的拷贝数变异情况，操作简单，结果准确可靠。并且结合atac-seq和rna-seq技术能够提供对wnt2b基因更全面的分析，揭示其染色质可及性状态和转录本的表达情况，进一步促进对该基因的功能和调控机制的理解，用于畜禽性别控制技术，便于种猪选育。

技术特征：

1.间性猪wnt2b基因的cnv标记，其特征在于：cnv标记位于wnt2b基因参考基因组序列nc_010454.4的chr-4:107914901-107923000。

2.根据权利要求1所述的间性猪wnt2b基因的cnv标记，其特征在于：cnv的内参基因为具有两个拷贝的β肌动蛋白基因、两个拷贝的x型胶原α1链基因和两个拷贝的胰高血糖素基因。

3.根据权利要求2所述的间性猪wnt2b基因的cnv标记，其特征在于：cnv标记的引物为：

4.根据权利要求1所述的间性猪wnt2b基因的cnv标记，其特征在于：标记的猪为间性猪中的38，xx-dsd，sry阴性猪。

5.间性猪wnt2b基因的cnv标记的应用，其特征在于：权利要求1-4任意一项所述的间性猪wnt2b基因的cnv标记用于种猪选育。

技术总结
本发明公开了间性猪WNT2B基因的CNV标记及应用，标记位于WNT2B基因，基因候选区域为chr‑4:107914901‑107923000，本发明是通过WNT2B基因的CNV标记用于种猪选育。本发明采用了10×Genomics de novo测序技术，并达到60×的测序深度，从而实现了99％以上的基因组覆盖率；能够更准确地发现导致38，XX‑DSD猪性别发育异常的致病基因。本发明检测了该CNV在猪群体中的分布情况，还采用了ATAC‑seq和RNA‑seq测序技术，从染色质可及性和转录本的表达量的角度印证WNT2B基因CNV标记的可靠性。

技术研发人员：李华,钟秉洲,郑文潇,吴金华,张博韬
受保护的技术使用者：佛山科学技术学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16