一种肺泡上皮细胞培养基、培养方法及其应用与流程

本发明涉及肺泡上皮细胞培养，尤其涉及一种肺泡上皮细胞培养基、培养方法及其应用。

背景技术：

1、肺泡上皮(alveolar epithelium)由两种细胞组成：ⅰ型肺泡上皮细胞(alveolartypeⅰcell，atⅰ)和ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar typeⅱcell，atⅱ)。传统的观点认为atⅱ是肺泡上皮中具有生物学活性的细胞，而终末分化的atⅰ只是被动地参与气血屏障的形成，不增殖，也不具有可塑性。但最近相关研究发现atⅰ不仅是传统意义上的终末分化细胞，还具有多样的生物学功能，并在损伤修复过程中发挥一定作用。虽然atⅰ数量只占全肺总细胞数的8％，但却覆盖了95％～98％的肺泡表面积。atⅰ参与气血屏障的形成，对于正常的换气功能非常重要。由于atⅰ易破裂，缺少生物学标记，分离相对困难，因此目前针对atⅰ的研究主要采用由atⅱ分化而来的atⅰ样细胞，但其生物学特性与atⅰ细胞存在一定差异。

2、现有技术通常利用酶消化法、igg贴壁法和免疫磁珠技术等分离得到高纯度的原代atⅰ，并初步观察其生物学特性；但目前的技术也仅限于能成功获取的原代atⅰ细胞，但并不能实现稳定传代；现有的atⅰ细胞的常规培养体系为高糖dmem培养基+10％fbs+100μg/ml青霉素和链霉素，细胞潜伏期为3天，从3-5天进入增殖，在8天时融合率仅有60％。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种肺泡上皮细胞培养基，能够解决现有的肺泡上皮细胞增殖效率低的问题，并且提供了一种肺泡上皮细胞扩增方法，能够解决现有的ⅰ型肺泡上皮细胞不能稳定传代的问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种肺泡上皮细胞培养基，包括基础培养基、ab血浆、反-4-羟基-l-脯氨酸和mem维生素溶液；

4、所述基础培养基中包括advanced dmem和上皮细胞培养基，所述基础培养基中advanced dmem和上皮细胞培养基的体积比为1:0.8～1.2。

5、优选的，所述ab血浆的添加量为基础培养基体积的3～8％；

6、所述反-4-羟基-l-脯氨酸的添加量为20～80mmol/l。

7、本发明还提供了上述肺泡上皮细胞培养基在肺泡上皮细胞的扩增培养和/或传代培养中的应用。

8、优选的，所述肺泡上皮细胞为ⅰ型肺泡上皮细胞。

9、本发明还提供了一种肺泡上皮细胞培养方法，将肺泡上皮细胞接种至上述肺泡上皮细胞培养基中，进行培养。

10、优选的，所述肺泡上皮细胞的接种量为1×104～5×105cell/ml。

11、优选的，所述培养采用的温度为35～38℃。

12、优选的，所述培养采用的co2浓度为3～8％。

13、优选的，所述培养采用的湿度为93～98％。

14、优选的，所述培养的过程中每1～3天更换一次培养基。

15、本发明的技术效果和优点：

16、本发明通过采用advanced dmem和上皮细胞培养基作为复合基础培养基，使用反-4-羟基-l-脯氨酸作为培养基添加剂，与其他试剂协同作用有效维持了atⅰ细胞的活率，实现了在短时间内获取数量充足的atⅰ细胞。本发明提供的肺泡上皮细胞培养基能够通过缩短已纯化的原代细胞潜伏期，同时维持细胞性质，避免细胞出现分化、老化等情况，进而激活细胞增殖，进入细胞周期。通过本发明提供的肺泡上皮细胞培养基能够同时满足atⅰ细胞原代和传代的需求，可使atⅰ细胞在体外稳定扩增3-5代，进而完成atⅰ细胞在体外的大规模扩增，实现批量化生产。

17、本发明提供的肺泡上皮细胞培养方法不仅能避免胎牛血清等成份引入动物源性病毒污染，还具有操作简单的优点，可用于迅速且规模化的细胞生产，为研究气血屏障的机制、以atⅰ损伤为特征的肺部疾病等研究提供了可靠基础。

技术特征：

1.一种肺泡上皮细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基、ab血浆、反-4-羟基-l-脯氨酸和mem维生素溶液；

2.根据权利要求1所述的肺泡上皮细胞培养基，其特征在于，所述ab血浆的添加量为基础培养基体积的3～8％；

3.权利要求1或2所述的肺泡上皮细胞培养基在肺泡上皮细胞的扩增培养和/或传代培养中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肺泡上皮细胞为ⅰ型肺泡上皮细胞。

5.一种肺泡上皮细胞培养方法，其特征在于，将肺泡上皮细胞接种至权利要求1或2所述的肺泡上皮细胞培养基中，进行培养。

6.根据权利要求5所述的肺泡上皮细胞培养方法，其特征在于，所述肺泡上皮细胞的接种量为1×104～5×105cell/ml。

7.根据权利要求5所述的肺泡上皮细胞培养方法，其特征在于，所述培养采用的温度为35～38℃。

8.根据权利要求5所述的肺泡上皮细胞培养方法，其特征在于，所述培养采用的co2浓度为3～8％。

9.根据权利要求5所述的肺泡上皮细胞培养方法，其特征在于，所述培养采用的湿度为93～98％。

10.根据权利要求5所述的肺泡上皮细胞培养方法，其特征在于，所述培养的过程中每1～3天更换一次培养基。

技术总结
本发明提供了一种肺泡上皮细胞培养基、培养方法及其应用，属于肺泡上皮细胞培养技术领域。本发明通过采用Advanced DMEM和上皮细胞培养基作为复合基础培养基，使用反‑4‑羟基‑L‑脯氨酸作为添加剂，与其他试剂协同作用，能够解决现有的肺泡上皮细胞增殖效率低的问题，并且提供了一种肺泡上皮细胞扩增方法，能够解决现有的Ⅰ型肺泡上皮细胞不能稳定传代的问题。本发明能够有效维持ATⅠ细胞的活率，实现在短时间内获取数量充足的ATⅠ细胞，通过缩短已纯化的原代细胞潜伏期，同时维持细胞性质，避免细胞出现分化、老化等情况，进而激活细胞增殖，进入细胞周期。

技术研发人员：谢佳琦,卢瑞珊
受保护的技术使用者：广州正源生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16